[发明专利]一种研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法

说明书

本发明属于动物育种学和细胞生物学领域，涉及一种研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法，包括如下步骤：Stra8基因3’UTR序列的获得；Stra8基因靶向miRNA预测；最佳miRNA筛选；验证miRNA通过stra8对精原干细胞减数分裂的作用；体内验证miRNA对公鸡生精的影响。相对于现有技术，本发明本方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。运用该方法可以快速、高效在短时间内验证Stra8基因在鸡减数分裂过程中的调控作用。并且能够很好的对Stra8基因进行抑制，以便更好在SSC中进行基因功能验证。

技术领域

本发明属于动物育种学和细胞生物学领域，涉及一种新的研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法。

背景技术

Stra8(stimulated byretinoic acid gene8)是生殖细胞由有丝分裂转变为减数分裂前特异表达的基因，在调控哺乳类和鸟类减数分裂的起始过程中起到关键作用。Stra8作为一个受RA诱导表达的基因，首先是在胚胎癌细胞、胚胎干细胞的培养中认识到的。Bouillet等用RA处理小鼠全能的P19胚胎癌细胞，筛选出50个受RA诱导表达的基因，其中Stra8是一个新发现的基因。后来发现在小鼠胚胎卵巢和出生后至成体的精巢中也有表达。在小鼠胚胎卵巢，Stra8表达一段时间后，dmcl(减数分裂过程中所需的重组酶)的表达从前向后波形增加，而维持多能干细胞所需的Oct4的表达也在Stra8表达后从前向后波形丧失。这表明Stra8是生殖细胞由有丝分裂转变为减数分裂前特异表达的基因。

miRNA调节生殖细胞的发育分化过程有很多种方式。miR17-92对维持生殖细胞增殖有重要作用，胚胎阶段雌性生殖细胞在减数分裂开始时miR17–92会下调也印证了这一点。Novotny等观察到miR17-92在睾丸精子发生过程中其表达也不断上调，从而通过抑制E2F1mRNA的翻译保护生精细胞免受凋亡的威胁，有利于正常的精子发生。Takada等研究证实，miR-29b在E13.5的4小鼠PGCs中表达，在E13.5-E17.5的雌性胚胎生殖细胞中表达上调，而在雄性胚胎生殖细胞则发生甲基化，这表明，miR-29b通过与Dnmt3a、Dnmt3b作用可调控PGC向雌性生殖细胞发生分化。miR-122a可能在小鼠精子发生过程中有一定作用，因其在小鼠睾丸内有不同程度表达，它还可能参与调控靶基因-转运蛋白间的互作，并对出生后生殖细胞的维持有一定的作用。人上的研究表明，miR-124a可与Sp3作用，通过与粗线期精母细胞或精子细胞的H1t/GC-box结合，进而激活H1t组蛋白启动子。Bjork等发现，miR-18可通过作用于热休克蛋白2(HSP2)使其表达量下调，进而在小鼠精子发生过程中发挥着一定的调控作用。MiR-469通过在精母细胞及球型精子期下调TP2和Prm2的表达而对精子的成熟起作用。

目前，构建Stra8过表达载体转染鸡ESC以研究Stra8在鸡雄性生殖细胞分化中的作用，该方法仅仅是对过表达Stra8在鸡雄性生殖细胞分化的研究，并未对Stra基因进行敲除或者抑制，即并不能系统的对Stra8基因的功能进行验证。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明提供一种周期短，效率及安全性高的研究Stra8基因在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能的方法，将靶向Stra8的miRNA转染鸡SSC，对Stra8基因进行抑制；慢病毒包裹miRNA转染SSC，可以让miRNA更好的整合，以便更好的进行RA诱导培养。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)Stra8基因3’UTR序列的获得；

(2)Stra8基因靶向miRNA预测；

(3)最佳miRNA筛选；

(4)验证miRNA通过stra8对精原干细胞减数分裂的作用；