[发明专利]一种针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法在审
申请号: | 201810916731.9 | 申请日: | 2018-08-13 |
公开(公告)号: | CN109234368A | 公开(公告)日: | 2019-01-18 |
发明(设计)人: | 徐志勇;秦伟 | 申请(专利权)人: | 武汉千麦医学检验所有限公司 |
主分类号: | C12Q1/6858 | 分类号: | C12Q1/6858;C12Q1/70 |
代理公司: | 武汉红观专利代理事务所(普通合伙) 42247 | 代理人: | 陈凯 |
地址: | 430011 湖北省武汉市江岸*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 乙型肝炎病毒 基序 耐药突变 分子生物学技术 耐药突变检测 耐药基因 特异引物 酶系统 敏感度 设计型 检测 双相 探针 突变 污染 | ||
1.一种针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变检测的方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)样本提取:提取血清中的HBV DNA模板;
(2)PCR扩增检测:以步骤(1)提取的HBV DNA为模板,利用以下试剂盒进行PCR扩增:
所述试剂盒包括检测rtM204I突变位点的特异性引物序列SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2,检测rtM204V突变位点的特异性引物序列SEQ ID NO.1和SEQID NO.3,检测rtL180M突变位点的特异性引物序列SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5;针对rtM204I/V突变位点对应的探针序列SEQ ID NO.6,针对rtL180M突变位点对应的探针序列SEQ ID NO.7,所述序列SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7的5’端标记有荧光基团,3’端标记有淬灭基团;包括RNase H2和热启动Taq DNA聚合酶的酶混合液,所述RNase H2酶与Taq DNA聚合酶浓度比为1:50~1:500权利要求3所述酶混合液,PCR缓冲液、dNTPs;以及PCR缓冲液、dNTPs;
(3)结果判定:根据各荧光通道的信号值来判断是否有扩增,有扩增就代表该荧光通道对应的检测位点为阳性,即有突变存在,没有扩增,就说明该通道对应的检测位点突变低于本试剂盒检测限。
2.如权利要求1所述的针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法,其特征在于:所述试剂盒包括如下试剂:
(1)PCR反应预混液1:主要成分包括:PCR缓冲液、4种dNTPs、SEQ ID NO.6、由SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2混合而成的引物组;
(2)PCR反应预混液2:主要成分包括:PCR缓冲液、4种dNTPs、SEQ ID NO.6、由SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3混合而成的引物组;
(3)PCR反应预混液3:主要成分有PCR缓冲液、4种dNTPs、探针SEQ ID NO.7、引物由SEQID NO.4和SEQ ID NO.5混合而成;
(4)酶混合液:主要成分包括:RNase H2和热启动Taq DNA聚合酶,所述RNase H2酶与Taq DNA聚合酶浓度比为1:50~1:500;
(5)阴性质控品:为经过灭活处理的YMDD突变阴性的正常人血清;
(6)阳性质控品:为经过灭活处理的YMDD rtM204I+rtL180M突变阳性的人血清;
其中,PCR扩增检测过程包括:将PCR反应预混液1、2和3分别和酶混合液按照36:0.5配成混合液后,加入到相应的反应孔中,然后加入提取的DNA模板后进行PCR扩增,并且做一个阴性对照孔和一个阳性对照孔;所述PCR扩增反应条件为:95℃预变性5分钟,然后95℃变性10秒,60℃退火延伸45秒,共35循环,收集荧光在退火延伸阶段。
3.如权利要求2所述的针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法,其特征在于:所述酶混合液中,RNase H2酶与Taq DNA聚合酶浓度比为1:250。
4.如权利要求2所述的针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法,其特征在于:所述探针序列SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的5’端标记有FAM荧光基团,3’端标记有淬灭基团BHQ1。
5.如权利要求2所述的针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法,其特征在于:所述引物序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的3'端连接有间隔臂。
6.如权利要求2所述的针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法,其特征在于:试剂盒内试剂还包括DNA提取液。
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