[发明专利]一种针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法

权利要求书

1.一种针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)样本提取：提取血清中的HBV DNA模板；

(2)PCR扩增检测：以步骤(1)提取的HBV DNA为模板，利用以下试剂盒进行PCR扩增：

所述试剂盒包括检测rtM204I突变位点的特异性引物序列SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2，检测rtM204V突变位点的特异性引物序列SEQ ID NO.1和SEQID NO.3，检测rtL180M突变位点的特异性引物序列SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；针对rtM204I/V突变位点对应的探针序列SEQ ID NO.6，针对rtL180M突变位点对应的探针序列SEQ ID NO.7，所述序列SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；包括RNase H2和热启动Taq DNA聚合酶的酶混合液，所述RNase H2酶与Taq DNA聚合酶浓度比为1:50～1:500权利要求3所述酶混合液，PCR缓冲液、dNTPs；以及PCR缓冲液、dNTPs；

(3)结果判定：根据各荧光通道的信号值来判断是否有扩增，有扩增就代表该荧光通道对应的检测位点为阳性，即有突变存在，没有扩增，就说明该通道对应的检测位点突变低于本试剂盒检测限。

2.如权利要求1所述的针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法，其特征在于：所述试剂盒包括如下试剂：

(1)PCR反应预混液1：主要成分包括：PCR缓冲液、4种dNTPs、SEQ ID NO.6、由SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2混合而成的引物组；

(2)PCR反应预混液2：主要成分包括：PCR缓冲液、4种dNTPs、SEQ ID NO.6、由SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3混合而成的引物组；

(3)PCR反应预混液3：主要成分有PCR缓冲液、4种dNTPs、探针SEQ ID NO.7、引物由SEQID NO.4和SEQ ID NO.5混合而成；

(4)酶混合液：主要成分包括：RNase H2和热启动Taq DNA聚合酶，所述RNase H2酶与Taq DNA聚合酶浓度比为1:50～1:500；

(5)阴性质控品：为经过灭活处理的YMDD突变阴性的正常人血清；

(6)阳性质控品：为经过灭活处理的YMDD rtM204I+rtL180M突变阳性的人血清；

其中，PCR扩增检测过程包括：将PCR反应预混液1、2和3分别和酶混合液按照36：0.5配成混合液后，加入到相应的反应孔中，然后加入提取的DNA模板后进行PCR扩增，并且做一个阴性对照孔和一个阳性对照孔；所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5分钟，然后95℃变性10秒，60℃退火延伸45秒，共35循环，收集荧光在退火延伸阶段。

3.如权利要求2所述的针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法，其特征在于：所述酶混合液中，RNase H2酶与Taq DNA聚合酶浓度比为1:250。

4.如权利要求2所述的针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法，其特征在于：所述探针序列SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1。

5.如权利要求2所述的针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法，其特征在于：所述引物序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的3'端连接有间隔臂。

6.如权利要求2所述的针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法，其特征在于：试剂盒内试剂还包括DNA提取液。