[发明专利]一种针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法

说明书

本发明提供了一种针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法，属于分子生物学技术领域。具体是运用RNase H2和Taq DNA聚合酶双相酶系统，针对HBVYMDD耐药基因突变rtM204I/V(C区)±rtL180M(B区)设计型特异引物及探针，实现乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变检测。本发明提供的方法敏感度高，检测快速，稳定性好，封闭式检测，减少了后期污染的可能性。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，属于体外诊断试剂领域耐药突变检测方法，具体涉及一种针对乙型肝炎病毒YMDD基序区耐药突变的方法。

背景技术

目前治疗慢性乙肝主要用干扰素或核苷类似物，如拉米夫定、阿德福韦、更昔洛韦等，干扰HBV复制来达到治疗的目的。拉米夫定(Lamivudine)，中文名贺普汀，是口服胞核嘧啶核苷类似物，由葛兰素史克公司在1992年研发成功并生产，1998年进入中国并被批准用于临床，拉米夫定服用方便、不良反应少，易为患者接受，是目前公认的最有效而安全的抑制病毒复制的核苷类似药物，该药的出现使抗HBV治疗发生了质的飞跃，使不适宜用α-干扰素治疗或治疗无应答病人有了新的治疗选择。

HBV基因组复制要通过逆转录机制才能进行，首先形成RNA复制中间体，而RNA复制中间体的形成需要逆转录酶的作用才得以进行，但该酶缺乏校对功能，逆转录过程中容易发生错配导致基因突变，在HBV基因组中逆转录聚合酶的催化结合部位有一个高度保守的YMDD基序，即酪氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸，拉米夫定能够与其特异性结合，通过抑制前基因组RNA逆转录为负链DNA及终止DNA链延伸而有效地抑制HBV DNA复制。

YMDD基序是聚合酶活性所必需的，是HBV逆转录酶的高保守区，变异后的HBV对拉米夫定的敏感性下降，从而导致治疗失败，甚至导致病情恶化。如果耐药突变发生后继续用药，不仅增加病人不必要的经济负担和造成社会资源的浪费，还可能存在严重的流行病学危害。临床上检测YMDD基序变异对调整治疗方案、合理用药及提高疗效具有重要的指导意义。

近年来报道了拉米夫定治疗乙肝过程中产生的耐药突变主要集中在552位氨基酸的YMDD→YIDD/YVDD，即在HBVYMDD基序区发生碱基替代G743T或A741G，即Atg→Att/Gtg，有趣的是有些耐药突变中除了这些碱基突变还常伴有其他碱基突变，如M552V突变总伴随着P基因B区的L528M突变，两种突变同时存在可能与M552V和M552I耐药性强弱有关。体外实验表明各种突变耐药的强弱顺序为：M552I＞L528M+M552V＞M552V＞L528M，目前有人建议将这些突变分为Ⅰ组(M552V/L528M)和Ⅱ组(M552I)。

按照新的命名法，拉米夫定相关的HBV耐药株的变异位置和类型为rtM204I/V(C区)±rtL180M(B区)，体外实验表明，rtL180M不仅能恢复C区突变株(rtM204I/V)的复制能力，而且能够增加对核苷类似物药物的耐受程度。提示两种突变联合出现比单一形式的突变可能更增加病毒的耐药性。

目前耐药突变的检测方法主要有以下几种：质谱分析，荧光偏振，PCR-肽核酸，限制性片段长度多态方法RFLP，线性探针分析法LiPA，荧光定量PCR熔解曲线分析法，PCR反向点杂交法。质谱分析、荧光偏振对技术和设备要求很高或者操作繁琐，不利于广大基层医院开展应用。

荧光PCR的优点是反应灵敏、特异性高：具有模版序列特异的Taqman探针在引物特异的基础上进一步提高的PCR的专一性；每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。有多种不同波长的荧光基团对可供选择，使得Taqman探针法可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性避免了荧光染料对PCR反应的影响。