[发明专利]一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法

权利要求书

1.一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法，其特征在于按照以下步骤进行：

(1)提取样本总RNA；

(2)以总RNA为原料合成First-strand cDNA，同时进行模板转换；

(3)在步骤(2)后加入PCR1反应体系，进行半巢式扩增，特异性扩增目标区域；

(4)在步骤(3)后进行产物纯化；

(5)在步骤(4)后加入PCR2反应体系，进行接头连接反应和扩增；

(6)在步骤(5)扩增产物后加入磁珠进行产物分选纯化，纯化后的产物即为TCR免疫组库文库。

2.根据权利要求1所述的一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法，其特征在于所述的样本是人源血液、组织或细胞。

3.根据权利要求1所述的一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法，其特征在于所述的合成First-strand cDNA是利用TCRαand/orβ特异性RT引物进行合成。

4.根据权利要求1所述的一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法，其特征在于所述的模板转换是利用带单分子标签的TS-3G引物进行模板转换，其中单分子标签是1-20个的兼并碱基，兼并碱基是原始碱基或修饰碱基，所述的修饰包括硫代、甲基化、LNA和次黄嘌呤。

5.根据权利要求1所述的一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法，

其特征在于所述的合成和模板转换反应条件是25-50℃，反应时间是30-90min。

6.根据权利要求1所述的一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法，其特征在于所述的PCR1反应体系包含缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs，特异性PCR引物和P5接头引物；其中特异性PCR引物为TCRαand/orβ特异性半巢式PCR引物，引物是原始碱基组成或者由修饰碱基组成，所述的修饰包括硫代、甲基化、LNA和次黄嘌呤；所述的P5接头引物3’端部分碱基与带单分子标签的TS-3G引物模板转换后的接头互补，5’端包含P5结合序列和Read 1测序序列。

7.根据权利要求1所述的一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法，其特征在于所述的PCR2反应体系包含缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs，P7接头引物和P5接头引物；其中P7接头引物包含P7结合序列，Index序列i7和Read2阅读序列；所述的P5接头引物与步骤(3)的PCR1反应体系中接头引物相同，或者为包含P5结合序列，Index序列i5和Read 1测序序列的接头。

8.根据权利要求1所述的一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法，其特征在于所述的TCR免疫组库文库大小为500-1000bp。

9.根据权利要求1所述的一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法，其特征在于所述的TCR免疫组库文库用于Roche、Illumina、ThermoFisher、PacificBiosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因高通量测序平台。