[发明专利]一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法。利用SMART技术和特异性引物，能够特异性捕获并无偏好扩增人源RNA中低丰度TCR‑α和TCR‑β转录本的整个V(D)J可变区域，也可单独捕获扩增TCR‑α或TCR‑β，或同时捕获扩增TCR‑α和TCR‑β。本发明能够最大程度消除扩增或测序过程中产生的碱基错误，还原原始样本中分子数目以及表达丰度，方法简便易行，建立的文库适用于多个测序平台。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法。

背景技术

第二代测序技术(NGS)已经越来越多地应用于人类T细胞受体(TCR，T cellreceptor)免疫组库的研究。不过，在利用传统方法生成TCR NGS测序文库时，或者只包含TCR可变区的一部分，或者需要用到复杂的多重PCR，会偏好性地扩增某个区域。因此如何完整并且无偏好地捕获并扩增TCR转录本中完整的V(D)J可变区，对免疫组库的研究具有重大意义。

Takara旗下Clontech的HumanTCR a/b Profiling试剂盒利用SMART技术和类似5’RACE的策略，可以捕获和无偏好扩增TCR-α和TCR-β转录本中完整的V(D)J可变区。大致步骤如下：1、获得总RNA或纯化的T细胞；2、利用TCR dT Primer和v4Oligonucleotide进行First-strand cDNA合成；3、PCR1扩增TCR-α和TCR-β整个可变区和绝大部分恒定区cDNA序列；4、PCR2利用半巢式引物扩增整个可变区和部分恒定区并加接头；5、纯化分选然而。该技术利用dT Primer进行RT，只能与具有Poly A尾的RNA进行RT，对低丰度的转录本有局限性，同时没有单分子标签纠错措施，故该方法有待优化。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法，在已有TCR免疫组库建库方法的基础上，利用单分子标签技术，目的是最大程度消除扩增或测序过程中产生的碱基错误，从而还原原始样本中分子数目以及表达丰度；同时本发明使用特异性引物扩增RNA样本中TCR-α和TCR-β基因全长，能够全面分析这两个基因的重排和表达信息。

本发明的单分子标签TCR免疫组库高通量测序文库的构建方法，按照以下步骤进行：

(1)提取样本总RNA；

(2)以总RNA为原料合成First-strand cDNA，同时进行模板转换；

(3)在步骤(2)后加入PCR1反应体系，进行半巢式扩增，特异性扩增目标区域；

(4)在步骤(3)后进行产物纯化；

(5)在步骤(4)后加入PCR2反应体系，进行接头连接反应和扩增；

(6)在步骤(5)扩增产物后加入磁珠进行产物分选纯化，纯化后的产物即为TCR免疫组库文库。

其中，所述的样本是人源血液、组织或细胞。

所述的合成First-strand cDNA是利用TCRαand/orβ特异性RT引物进行合成。

所述的模板转换是利用带单分子标签的TS-3G引物进行模板转换，其中单分子标签是1-20个的兼并碱基，兼并碱基是原始碱基或修饰碱基，所述的修饰包括硫代、甲基化、LNA和次黄嘌呤。

所述的合成和模板转换反应条件是25-50℃，反应时间是30-90min。