[发明专利]OPCML基因启动子甲基化水平的检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种OPCML基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒，其特征在于，包括以下物质：

(a)酶切反应液(10μL/测试)，包括双蒸水7μL，10×Buffer R 2μL，Bsh1236I 1μL；

(b)OPCML基因的引物及探针组，序列为：

其中：序列中大写字母为DNA序列，小写字母为RNA序列；

(c)PCR工作液

；

(d)标准品1-5，浓度分别为7.0×10⁷copies/mL、7.0×10⁶copies/mL、7.0×10⁵copies/mL、7.0×10⁴copies/mL、7.0×10³copies/mL。

2.一种如权利要求1所述的OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

(A)取患者血清10μL加入到酶切反应液中，轻轻混匀后37℃孵育16小时，标准品与血清同步处理；

(B)取上述酶切DNA 5μL加入到PCR工作液中，进行PCR检测；

(C)结果判断：根据标准曲线自动计算未知标本的相应基因拷贝浓度，若发现有标本Ct值小于15，须将其剔除此次结果分析，该标本稀释后再测直至其Ct值大于15。

3.一种如权利要求1所述的OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)亚硫酸氢盐处理后测序法检测卵巢癌组织中OPCML基因启动子的甲基化状态，具体为：

(1-1)取卵巢癌组织标本20-25mg，用剪刀剪碎后放入1.5mL的离心管中，利用DNA抽提试剂盒抽提组织样本中的DNA，抽提的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度，利用DNA修饰试剂盒修饰提取后的DNA，然后把修饰后的DNA溶解在20μLBuffer TE中；

(1-2)引物系列为：

上游引物5'-GTTTTTTTTGTAGG-GGAAGT-3'，

下游引物5'-CAACAACTCCATCCCTAACC-3'，产物长度243bp；

对修饰后的DNA进行PCR扩增，反应体系25μL，包括：

修饰后的DNA 2μL，10×Buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，25mmol/L MgCl₂ 1μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，5U Taq酶0.2μL，无菌蒸馏水16.3μL；

循环条件：

(1-3)利用PCR产物胶纯化试剂盒对步骤(1-2)取得的PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物与质粒连接，转化到感受态细菌中进行蓝白斑筛选，挑取10个白色阳性克隆进行测序，对测序结果与基因组序列进行比对，分析OPCML基因启动子的甲基化状态；

(2)根据步骤(1)的分析结果确定扩增位置及设计引物，引物及探针系列包括：

；

(3)选取OPCML基因启动子甲基化阳性样本，制备标准品

(3-1)在步骤(1-3)的测序确定阳性的标本中选取1个组织进行DNA提取；

(3-2)将步骤(3-1)提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度；

(3-3)对步骤(3-2)提取的DNA进行PCR扩增，引物为OPCML-F和OPCML-R，反应体系为：

反应参数为：

(3-4)利用PCR产物胶纯化试剂盒，对步骤(3-3)得到的PCR产物进行纯化；

(3-5)步骤(3-4)所得纯化产物与PGEM-T Easy Vector连接，将连接后的产物转染到DH5α细胞中，方法同步骤(1-3)，然后选取白色克隆产物进行测序，确定测序后的阳性克隆产物的序列与目标基因一致；

(3-6)质粒提取，然后将质粒DNA用无菌蒸馏水稀释20倍，然后用紫外分光光度计测OD260，通过OD260和分子量计算拷贝数：

copies/mL＝(6.02×10²³copies/mol)×(浓度g/mL)/(MW g/mol)；

对已知拷贝数标准品进行倍比稀释，形成6个梯度：7.0×10²-7.0×10⁷copies/mL；

(4)甲基化敏感的限制性内切酶MSRE酶切处理DNA样本，酶切体系为：

轻轻混匀后37℃孵育16h；

(5)MNAzyme qPCR扩增步骤(4)中酶切后的DNA样本，反应体系为：

(6)MSRE MNAzyme qPCR的线性范围、特异性、灵敏度及重复性实验

(6-1)线性范围：以步骤(3)制备的6个标准品进行MSRE MNAzyme qPCR，确定其线性范围；

(6-2)特异性：以阳性标本和阴性标本进行PCR扩增，用扩增曲线的状态判断特异性；

(6-3)灵敏度：用已知拷贝数的标准品，进行倍比稀释，能够扩增出曲线的最低检测限，判断灵敏度；

(6-4)重复性：选取一个已知拷贝数的标准品，进行PCR扩增，分别在同一时间内扩增8次进行批内重复性测定，在不同的时间内扩增8次进行批间重复性测定；

(7)用MSRE MNAzyme qPCR法检测卵巢癌患者血清中OPCML基因启动子甲基化水平

检测临床标本血清，用甲基化敏感的限制性内切酶BstUI酶切，酶切体系为：

轻轻混匀后37℃孵育16小时；

MNAzyme qPCR：上述酶切后DNA作为模板，反应体系为：

反应参数为：

检测多例卵巢癌患者血清的OPCML基因甲基化水平，并进行统计学分析。