[发明专利]OPCML基因启动子甲基化水平的检测试剂盒及其应用

说明书

本发明提供一种OPCML基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒，包括以下物质：(a)酶切反应液(10μL/测试)，包括双蒸水7μL，10×Buffer R 2μL，Bsh1236I 1μL；(b)OPCML基因的引物及探针组；(c)PCR工作液；(d)标准品1‑5，浓度分别为7.0×10⁷copies/mL、7.0×10⁶copies/mL、7.0×10⁵copies/mL、7.0×10⁴copies/mL、7.0×10³copies/mL。利用本发明的试剂盒及MSRE结合MNAzyme qPCR技术，可快速、准确地检测出卵巢癌患者外周血中OPCML基因启动子甲基化水平。

技术领域

本发明涉及一种OPCML基因启动子甲基化水平的检测试剂盒及其应用，尤其用于MSRE结合MNAzyme qPCR检测卵巢癌患者外周血中OPCML基因启动子甲基化水平。

背景技术

目前，卵巢癌发病率位居女性生殖系统恶性肿瘤第三位，病死率居第一位，占所有因癌症死亡女性患者的3％。卵巢癌90％以上为上皮性卵巢癌，发病隐匿，临床确诊时约80％患者疾病已为晚期，预后差。晚期卵巢癌(FIGOⅡ-Ⅳ期)患者5年生存率仅为30～45％，而早期卵巢癌(FIGOⅠ期)患者5年生存率高达90％以上。因此，除积极寻找新的有效的治疗方式外，探讨卵巢癌发生发展的生物学机制，研发新型卵巢癌早期诊断技术迫在眉睫。

现有技术中尚无简便有效的、精确的、可常规用于卵巢癌早期诊断的检测方法。CA125是目前普遍使用的卵巢癌标志物，但仅有50～60％的I期卵巢癌患者CA125水平升高，且其他疾病如卵巢子宫内膜异位囊肿等亦可引起CA125水平升高，故其敏感性和特异性较差，卵巢癌阳性预测值仅有10％～35％。总体而言，对于血清CA125检测、经阴道超声探查等传统的早期诊断方法单一或联合应用，目前均无证据显示可降低人群的卵巢癌发病率和(或)病死率。其主要原因在于这些方法的假阴性或假阳性率均过高，敏感性和特异性达不到临床需要。

DNA甲基化是一项重要的表观遗传学机制，在人类癌症发生发展中发挥着重要的作用。特定基因的启动子区甲基化异常引起了人们的广泛关注，被认为是癌症诊断的潜在标志物。在癌症中只有极少数的单独基因被证明是甲基化比例很高的。因此，检测一组基因的甲基化状态，与检测单独基因的甲基化状态相比，诊断灵敏度更高、特异性更好。目前研究已证实原发性卵巢癌可有多种抑癌基因的甲基化，提示卵巢癌显示出CpG岛甲基化表征。作为癌症发生的早期事件，抑癌基因DNA异常甲基化检测可以在患者出现临床表现或者影像学证据之前做到分子诊断，为卵巢癌的早期诊断提供了新的途径。

目前，研究已证实癌症患者血清富含肿瘤DNA(Serum free circulating DNA，SfcDNA)，可用于癌症分子生物学诊断。使用体液标本(血清、尿液等)检测其中游离肿瘤特异DNA在其他癌症如肺癌、头颈部肿瘤、前列腺癌等已被证实可行。更为重要的是，肿瘤游离DNA不仅在晚期转移癌症患者血清内存在，对于早期患者，血清内同样可检测到肿瘤游离DNA，研究认为其来源于侵入体内循环但无浸润机体实质器官能力的肿瘤细胞，或是由凋亡肿瘤细胞释放进入体内循环。因此，利用血清游离DNA(SfcDNA)进行癌症的早期分子生物学诊断是当前研究的一大热点。

虽然国内外研究者利用卵巢癌患者血清游离DNA甲基化检测，在卵巢癌早期诊断中的研究取得了令人振奋的进步，但是在实际操作过程中存在以下局限性：1、血清游离DNA微量(正常人浓度平均为：0.03ug/ml，肿瘤患者浓度平均为0.18ug/ml)，并且多以小片段形式存在，大大增加了提取的难度，降低了临床检测的敏感性和特异性；2、目前DNA甲基化的主要研究方法为甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)，其操作繁琐，DNA经亚硫酸氢盐修饰后丢失严重，一般只用于单个基因检测，特异性和敏感性均较低；3、卵巢癌抑癌基因失活的不确定性及血清游离DNA的局限性，导致单一卵巢癌甲基化标记物检测无法满足临床要求。

发明内容