[发明专利]石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法

权利要求书

1.石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)、内生真菌的分离：石斛兰进行表面灭菌处理后，将其接种于培养基上，在23～27℃孵化4～6天，然后分离出内生真菌菌株；

步骤2)、内生真菌菌体和代谢产物的分离：利用水循环多功能真空泵将所述内生真菌菌株的菌体和代谢产物进行分离，并将分离后的内生真菌菌体进行冷冻干燥；

步骤3)胞内石斛碱的提取：冻干后的内生真菌菌体研磨成粉末状，使用氯仿浸泡后转移至离心管中进行离心分离；分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；

步骤4)、胞外石斛碱的提取：将步骤2)中的代谢产物和氯仿混合后进行离心分离，分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；留取过滤后的滤渣，所述滤渣即为目标提取物。

2.根据权利要求1所述的石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，其特征在于：所述步骤1)中石斛兰进行表面灭菌的方法是先用75％的酒精消毒30s后取出，再用0.1％的氯化汞消毒28～32min，取出，最后再紫外照射18～22s。

3.根据权利要求2所述的石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，其特征在于：所述步骤1)中所述培养基为马铃薯葡萄糖培养基，培养基的pH值为6.4。

4.根据权利要求3所述的石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，其特征在于：步骤1)中孵化温度为25℃，时间为5天。

5.根据权利要求4所述的石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，其特征在于：所述步骤1)分离出的内生真菌菌株接种到另一培养基中，再于25℃孵化14天后进行离心分离，转速为120rpm/min。

6.根据权利要求5所述的石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，其特征在于：所述步骤3)中100mg冻干内生真菌菌体粉末，采用50mL的氯仿浸泡12h后进行离心分离，离心分离的转速为180rpm/min。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，其特征在于：所述步骤4)中代谢产物与氯仿的容积比为1:1；浸泡12h后进行离心分离，离心分离的转速为180rpm/min。