[发明专利]石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法

说明书

本方案公开了植物真菌中提取化合物的技术领域，石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，该方法从石斛兰植物中分离出内生真菌菌株，将内生真菌菌株的菌体和代谢产物进行分离，并将分离后的内生真菌菌体进行冷冻干燥；冻干后的内生真菌菌体研磨成粉末状，使用氯仿浸泡后转移至离心管中进行离心分离；分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿再次溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤得到胞内石斛碱；代谢产物和氯仿混合后进行离心分离，分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿再次溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤得到胞外石斛碱。本发明首次从石斛兰的内生真菌中提取分离出石斛碱，扩大了石斛碱的来源。

技术领域

本发明涉及植物内生真菌中提取分离化合物的技术领域，具体涉及一种石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法。

背景技术

近年来，植物内生真菌的研究备受关注，内生真菌生活在植物体内的特殊环境中，并与宿主协同演化，在演化过程中二者形成互惠共生关系，一方面内生真菌可以从宿主中吸收营养供给自己生长需要，另一方面，内生真菌在宿主的生长发育和系统演化过程以及抗植物病虫害中起着重要的作用。据报道，一些内生真菌中还可发现有药用植物所产生的活性物质。

石斛碱是一种吡咯里西啶衍生物类生物碱，是从兰科植物石斛兰(Dendro biumnobile Lindl)的茎中提取分离得到，也是石斛兰的主要药用活性成分。石斛碱具有解热、眼部矫正、炎症调节、保护胃肠粘膜损伤和抗衰老剂等多种药用价值。抑制A549细胞的生长，这与肺癌有关，有显著的治疗甲型H₁N₁流感等病毒感染的效果，因此，对其进行研究开发具有较高的临床价值。

石斛兰在中国传统药用植物中得到了广泛的应用，而目前关于石斛碱的获取，主要集中在植物提取和化学合成技术方面，石斛兰的石斛碱活性成分在医药、化工等领域引起了越来越多的关注，但在植物中，石斛碱的生产量却很少。然而，目前大多数的研究者和研究课题都关注于草本中的石斛碱，由于技术上的局限性，目前还没有对石斛兰中分离出来的内生真菌中的石斛碱提取分离进行研究。

发明内容

本发明意在提供一种石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，以解决目前还未有从石斛兰内生菌中获取石斛碱的技术问题。

本方案中的石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，包括以下步骤：

步骤1)、内生真菌的分离：石斛兰进行表面灭菌处理后，将其接种于培养基上，在23～27℃孵化4～6天，然后分离出内生真菌菌株；

步骤2)、内生真菌菌体和代谢产物的分离：利用水循环多功能真空泵将所述内生真菌菌株的菌体和代谢产物进行分离，并将分离后的内生真菌菌体进行冷冻干燥；

步骤3)、胞内石斛碱的提取：冻干后的内生真菌菌体研磨成粉末状，使用氯仿浸泡后转移至离心管中进行离心分离；分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；

步骤4)、胞外石斛碱的提取：将步骤2)中的代谢产物和氯仿混合后进行离心分离，分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；留取过滤后的滤渣，所述滤渣即为目标提取物。

本发明的有益效果是：本发明先对石斛兰植株表面进行灭绝操作，避免从石斛兰内部分离出来的内生真菌含有杂菌而影响内生真均的生长繁殖。对分离出来的内生真菌进行孵化获得内生真菌菌株，孵化过程中产生的代谢产物与内生真菌菌株进行分离，以便于独立的从内生真菌菌株和代谢产物中提取出石斛碱。