[发明专利]鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点及其方法

权利要求书

1.鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点，其特征在于：所述酶切位点为ACACGT。

2.获得含有权利要求1所述酶切位点的序列片段的引物对，其特征在于：所述引物对为：

V-F：5’-TCATCCATTAGTGATGTTGTGTTAGG-3’，

V-R：5’-CGACAACRATRTTTTTTCCATCCTG-3’；其中，

合并碱基R为A/G，合并碱基Y为C/T。

3.鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)获取待测目标样品；

2)提取待测目标样品的RNA；

3)RNA反转录成cDNA；

4)以所获得的cDNA为模板加入引物对进行RT-PCR扩增，扩增得到PCR产物后用琼脂糖凝胶电泳法分析，确定是否为猪流行性腹泻病毒变异毒株；

5)当待测目标样品为猪流行性腹泻病毒变异毒株时，使用AflIII酶对PCR产物进行酶切，确定变异毒株是否为猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144。

4.根据权利要求3所述鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的方法，其特征在于：所述步骤4)中，引物对为：

V-F：5’-TCATCCATTAGTGATGTTGTGTTAGG-3’，

V-R：5’-CGACAACRATRTTTTTTCCATCCTG-3’；其中，

合并碱基R为A/G，合并碱基Y为C/T。

5.根据权利要求4所述鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的方法，其特征在于：所述步骤4)中，

若电泳观测到大小为720bp，即确定待测目标样品为猪流行性腹泻病毒变异毒株；

否之，即确定待测目标样品不是猪流行性腹泻病毒变异毒株。

6.根据权利要求5所述鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的方法，其特征在于：所述步骤5)中，若PCR产物被酶切为523bp和197bp两条片段时，确定变异毒株为猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144；

否之，确定变异毒株不为猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144。

7.根据权利要求3所述鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的方法，其特征在于：所述步骤4)中，RT-PCR反应体系为

反应体系：2×Es Taq MasterMix 12.5μL，上游引物V-F 1μL，下游引物V-R 1μL，去离子水6.5μL，DNA模板4μL；

RT-PCR反应条件为94℃5min；95℃35s，58.4℃35s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。

8.根据权利要求3所述鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的方法，其特征在于：所述步骤5)中，

酶切反应体系：25μL酶切体系为：0.5μL AflIII酶，0.5μg DNA，2.5μL 10×NEBuffer；

酶切反应条件：酶切管置于37℃水浴锅中反应1～2h。