[发明专利]鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点及其方法

说明书

本发明公开了一种鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点及其方法。所述酶切位点为ACACGT。该方法首先获取待测目标样品并反转录成cDNA，以所获得的cDNA为模板加入引物对进行RT‑PCR扩增，扩增得到PCR产物后用琼脂糖凝胶电泳法分析，确定是否为猪流行性腹泻病毒变异毒株；当待测目标样品为猪流行性腹泻病毒变异毒株时，使用AflIII酶对PCR产物进行酶切，确定变异毒株是否为猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144。本发明的RT‑PCR检测敏感度可达到1×10^0.7TCID₅₀/100μL病毒量或1.27×10³copies/μL质粒量；该RT‑PCR方法结合酶切方法，鉴别变异毒株和变异弱毒株YN144。

技术领域

本发明涉及生物毒株鉴别技术领域，具体涉及一种鉴定鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点及其方法。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起我国仔猪腹泻的重要病原，影响我国养猪业的发展，给猪场造成了巨大损失。各日龄猪均易感，哺乳仔猪感染率和病死率最高。在仔猪中以引起呕吐、脱水、水样腹泻和严重的肠炎为主要特征(刘政龙等，2015)。2010年，PEDV变异毒株引起的PED在我国暴发，由于经典疫苗对流行的变异毒株的保护力不够，导致我国规模化养殖场陆续出现仔猪严重腹泻，大量死亡的情况(LiWT et al.,2012,Sun R Q et al.,2012)。

目前，我国流行的主要PEDV毒株为变异毒株，占比90％以上，成为危害我国养猪业重要病原之一。由于PEDV毒株之间的交叉保护力不一样，毒株类型影响疫苗免疫效果，因此PEDV变异弱毒疫苗的研发和其对应的鉴别方法的建立对于PED疫苗的推广、使用以及PED的防控具有重要意义。2013年本实验室分离到一株变异毒株，命名YN1(GenBank NO：KT021227)，经过Vero细胞上连续传代至144代，获得了一种来源于高度适应细胞的毒株YN144(GenBank NO：KT021232)。通过动物实验证实已适应细胞的15代病毒YN-15(GenBankNO：KT021228.1)仍为强毒力野毒株，而YN-144为致弱毒株(Chen FZ et al.,2015)，随后对变异弱毒YN144进行了临床评估，证明该毒株安全性和对变异毒株引起的PED有很好的保护性,可作为疫苗候选株(刘洋，2016)。

目前检测PEDV的经典疫苗毒株(CV777)的RT-PCR方法有很多，但还没有鉴别PEDV变异弱毒的检测方法。经典疫苗毒株(CV777)的鉴别是根据ORF3基因连续缺失49个核苷酸的特点，在基因缺失两端设计引物，通过RT-PCR方法扩增，所得到的经典疫苗毒株(CV777)ORF3基因片段比经典野毒少49bp，从而可鉴别出PEDV经典野毒与CV777疫苗株(李长龙等2014)。目前猪场流行的PEDV的毒株主要为变异毒株，而来源于变异毒株的疫苗比经典毒株疫苗能提供更好的保护力，因此变异毒株和变异弱毒疫苗的鉴别在免疫与监测上至关重要。YN144为致弱的变异毒株，具有较好的安全性和临床应用效果(刘洋，2016)，是比较理想的弱毒疫苗候选株，

因此，建立区分变异弱毒株YN144诊断方法，对于YN144推广使用和PED防控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点及其方法。本研究通过比对分析传代致弱株YN144与强毒株YN15以及其他变异毒株的序列，找到YN144在S1基因存在“AACAGGT”6个碱基的连续缺失，缺失两端可形成AflIII酶切位点(ACACGT)。因此本研究结合RT-PCR和酶切方法，建立鉴别变异弱毒YN144的方法，为新疫苗推广和使用提供了鉴别诊断的技术，从而更好指导疫苗使用，防控PED。

为实现上述目的，本发明设计了一种鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点，所述酶切位点为ACACGT。