[发明专利]一种羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库及构建方法

权利要求书

1.一种羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库的制备方法，包括以下步骤：

1)制备羊睾丸成纤维细胞；

2)提取羊睾丸成纤维细胞RNA；

3)合成cDNA，进行cDNA文库均一化；

4)cDNA与pPR3-N载体连接，连接产物转化宿主细胞DH5α，获得羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库，并进行克隆验证；

5)筛选羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库；

所述提取羊睾丸成纤维细胞RNA的方法为将步骤1)所述羊睾丸成纤维细胞培养5-6代后利用Trizol试剂法提取获得；

所述羊睾丸成纤维细胞的制备方法包括：

1)无菌取出初生健康羊羔羊睾丸，用Hank’s液洗2-3次，剔除鞘膜、白膜后，再冲洗2-3次；

2)将睾丸实质剪成1-2mm大小的组织块，加入4倍量的0.25％胰酶消化液，于37℃水浴中消化30-40分钟；

3)用含10％犊牛血清的营养液制成细胞悬液，用碳酸氢钠调pH至7.0，置25mm细胞培养瓶中，37℃、5％CO₂培养，3-4天细胞长成致密的单层细胞；

4)然后利用PBS洗2次，加1ml胰酶，37℃、5％CO₂放置2min，加入培养基按一定的比例分置其他细胞瓶，如此传5-6代，细胞生长稳定；

所述cDNA文库均一化包括杂交处理、DSN消化处理、两次PCR扩增放大，并对PCR两次放大进行SfiI消化的步骤；

所述筛选羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库包括构建诱饵载体、鉴定诱饵质粒与筛选羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库。

2.根据权利要求1所述的羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库的制备方法，其特征在于，所述合成cDNA包括反转录法合成cDNA第一链与LDPCR合成cDNA第二链。

3.根据权利要求1所述的羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞DH5α为宿主细胞DH5α感受态细胞。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的制备方法获得羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库。

5.根据权利要求4所述的羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库，其特征在于，所述cDNA文库容量为7.5×10⁵，片段的大小为200-2000bp，平均长度为1000bp，文库的重组率为100％。