[发明专利]一种羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库及构建方法

说明书

本发明提供了一种羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库的制备方法，包括制备羊睾丸成纤维细胞；提取羊睾丸成纤维细胞RNA；合成cDNA，进行cDNA文库均一化；cDNA与pPR3‑N载体连接，连接产物转化宿主细胞DH5α，获得羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库，并进行克隆验证；筛选羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库等步骤。本发明的cDNA库容量为7.5×10⁵，片段的大小为200‑2000bp，平均长度为1000bp，文库的重组率为100％。通过利用羊口疮病毒的膜蛋白对文库进行筛选，证明了该文库是一个高质量的文库。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库及其构建方法和用途。

背景技术

羊口疮(orf)亦称羊传染性脓疱、羊传染性脓疱皮炎，是由羊口疮病毒(orf virusORFV)引起的一种传染性较强的人畜共患病。ORFV为痘病毒科(Poxviridae)、副痘病毒属(Parapoxvirus)的代表之一；病毒粒子为椭圆形，长250～280nm，宽170～200nm；引起羊的一种病毒性传染病，也可以感染人。感染羊口疮病毒的羊生产性能下降、采食困难、消瘦并长期带毒，给养羊业及饲养人员的健康带来严重的危害。该病几乎遍布全世界所有养羊的国家和地区，而且我国是该病流行严重的国家，每年感染ORFV的羊不少于500万只。

一些研究者发现，能用于分离培养ORFV的原代细胞和细胞系有很多种，1957年羊口疮病毒在羊胚胎原代细胞上成功复制此病毒，但细胞病变不是十分明显。此后用犊牛睾丸原代细胞、羔羊睾丸原代细胞成功增殖了羊口疮病毒，并观察到了典型的细胞病变反应。但是羊睾丸细胞(LT)均是来源于羔羊睾丸，经解剖、剪碎、消化、培养而成的原代细胞，该细胞生长缓慢，繁殖一定代数后会停止生长，传代次数有限，随着传代次数的升高，细胞活力降低，细胞形态也随之越来越差，最后无法进行传代，因此，羊睾丸细胞培养的质量的好坏，对于ORFV的分离和培养是十分重要的，而且羊睾丸细胞成为研究ORFV与宿主间相互作用的平台。

发明内容

传统的酵母双杂交文库只能检测发生在核内的蛋白质间相互作用，无法检测胞膜蛋白质间相互作用，也不能够检测一些蛋白质需在内质网或细胞质中经过转录后修饰的蛋白质，有鉴于此，本发明的目的在于提供一种羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库的制备方法,通过该方法构建的羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库克服了传统酵母双杂交文库的局限，可用于检测膜蛋白间的相互作用。

即本发明的第一方面在于提供一种羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库的制备方法，包括以下步骤：

1)制备羊睾丸成纤维细胞；

2)提取羊睾丸成纤维细胞RNA；

3)合成cDNA，进行cDNA文库均一化；

4)cDNA与pPR3-N载体连接，连接产物转化宿主细胞DH5α，获得羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库，并进行克隆验证；

5)筛选羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库。

优选地，本发明所述的羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库的制备方法中，所述羊睾丸成纤维细胞的制备方法包括：

1)无菌取出初生健康羔羊睾丸，用Hank’s液洗2-3次，剔除鞘膜、白膜后，再冲洗2-3次；

2)将睾丸实质剪成1-2mm大小的组织块，加入4倍量的0.25％胰酶消化液，与37℃水浴中消化30-40分钟；

3)用含10％犊牛血清的营养液制成细胞悬液，置25mm细胞培养瓶中，37℃、5％CO₂培养，3-4天细胞长成致密的单层细胞；