[发明专利]一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法

权利要求书

1.一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，获取自体成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中30min～60min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的DMEM培养液，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃温度条件下，5％CO₂恒温培养；

步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的DMEM培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的DMEM培养液重取出；

步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；

步骤四，获取注射剂，将成纤维细胞和胶原蛋白从无血清培养基中取出，用磷酸缓冲盐溶液清洗洗去培养基，加入林格氏液、葡萄糖液、肉毒杆菌混合均匀，制成自体胶原蛋白注射剂，4℃保存。

2.如权利要求1所述的一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，在步骤一中，离心速度为1200rpm～3500rpm，离心时间为2min～5min。

3.如权利要求1所述的一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，在步骤二中，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶。

4.如权利要求1所述的一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，在步骤三中，成纤维细胞在无血清培养基中培养时间为12h～60h。

5.如权利要求1所述的一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，在步骤四中，每10g成纤维细胞和胶原蛋白中加入林格氏液5ml～20ml、葡萄糖液10ml～30ml、肉毒杆菌5μg～20μg。

6.如权利要求5所述的一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，在步骤四中，自体胶原蛋白注射剂中还加入有几丁质。

7.如权利要求6所述的一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，在步骤四中，每10g成纤维细胞和胶原蛋白中加入几丁质0.2g～2g。

8.如权利要求7所述的一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，在步骤四中，自体胶原蛋白注射剂中还加入有成纤维细胞生长因子。

9.如权利要求8所述的一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，在步骤四中，每10g成纤维细胞和胶原蛋白中加入成纤维细胞生长因子2mg～10mg。