[发明专利]一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法

说明书

本发明涉及一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，属于医学美容技术领域，包括以下步骤：步骤一，获取自体成纤维组织；步骤二，传代培养；步骤三，胶原蛋白积累；步骤四，获取注射剂。该技术方案通过将自体的成纤维细胞分离，通过成纤维细胞分泌出胶原蛋白，在作为自体胶原蛋白注射剂后能够减少人体排异反应，并将肉毒杆菌与自体胶原蛋白注射剂结合，在利用肉毒杆菌造成皱纹的肌肉麻痹掉，使肌肉不收缩的同时，利用注射剂内的成纤维细胞和其他活性成分，保证机体内组织相容性，提高皱纹祛除效果。

技术领域

本发明涉及一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，属于医学美容技术领域。

背景技术

皱纹是指皮肤受到外界环境影响，形成游离自由基，自由基破坏正常细胞膜组织内的胶原蛋白、活性物质，氧化细胞而形成的小细纹、皱纹。皱纹的发生归结起来有4个原因：自然老化、地心引力作用、阳光中紫外线照射使皮肤发生光老化与光损伤和面部表情肌过多的收缩。其中面部表情肌过多的收缩产生的皱纹称动力性皱纹，主要表现为眶外侧的鱼尾纹，额头纹和眉间纹、鼻唇沟纹和唇上纹和颈阔肌纹。除皱有许许多多的办法，局部外用各种各样的除皱霜、抗皱霜、防晒霜只能改善外观，它对皱纹的消除不会有较大的作用。医用胶原注射充填术有效，但因为是非自身物质，只能存在几个月就会被机体清除，同时注射后会有一定的过敏反应。

胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，约占胶原纤维固体物的85％，占动物体内蛋白质总量的25％～30％，它广泛存在于动物的结缔组织 (骨、软骨、皮肤、腱、韧等)中，对机体和脏器起着支持、保护、结合，以及形成界隔等作用。人体皮肤下层也有致密排布的胶原蛋白存在，皮肤的厚度和成分会随着年龄增加而改变，老年人的皮肤很容易受伤，且不易愈合，这很可能是因为上层皮肤成纤维细胞缺失所致，若能刺激这些细胞生长，就有可能恢复皮肤的弹性，同样还能刺激毛囊形成，减少疤痕。通过自体胶原蛋白注射的方式去除皱纹，能够显著减少过敏反应，但是单纯的胶原蛋白注射容易被机体降解，不能根本性的解决皱纹问题，为此，对现有的医用胶原注射填充物进行改进，对提高提高对皱纹的去除效果具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明实施例提供了一种自体胶原蛋白注射剂的制备方法，通过对自体成纤维细胞进行培养后作为注射填充物，再结合肉毒杆菌，实现祛除皱纹的作用。具体技术方案如下：

一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，获取自体成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中30min～60min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的DMEM培养液，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃温度条件下， 5％CO₂恒温培养；

步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的 DMEM培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的DMEM培养液重取出；

步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；

步骤四，获取注射剂，将成纤维细胞和胶原蛋白从无血清培养基中取出，用磷酸缓冲盐溶液清洗洗去培养基，加入林格氏液、葡萄糖液、肉毒杆菌混合均匀，制成自体胶原蛋白注射剂，4℃保存。

作为上述技术方案的改进，在步骤一中，离心速度为1200rpm～ 3500rpm，离心时间为2min～5min。

作为上述技术方案的改进，在步骤二中，胰蛋白酶为质量分数为 0.25％的胰蛋白酶。

作为上述技术方案的改进，在步骤三中，成纤维细胞在无血清培养基中培养时间为12h～60h。