[发明专利]慢病毒感染试剂及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种慢病毒感染试剂及其制备方法与应用，慢病毒感染试剂包括第一组合物和第二组合物；第一组合物包括二油酰基L‑α‑磷脂酰乙醇胺；第二组合物包括聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物；第一组合物和第二组合物分别独立包装。本发明提供的慢病毒感染试剂，创新地使用低毒性阳离子聚合物和非离子表面活性剂作为感染试剂，一方面可以降低传统感染试剂的细胞毒性，扩展感染试剂的使用范围，另一方面可以提高慢病毒感染效率和整合效率，感染效率和整合效率显著超过溴化己二甲铵，降低病毒使用量，降低制备成本，使用快速简便，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种慢病毒感染试剂及其制备方法与应用。

背景技术

慢病毒技术是一种将外源基因或DNA片段整合到宿主细胞染色体上的基因工程技术，它借助于慢病毒，慢病毒是一种工程性的假病毒，在HIV-1病毒的基础上由基因工程方法改造而来。可以感染宿主细胞非常广泛，包括了各种人源和动物源的原代细胞、肿瘤细胞、干细胞、神经元细胞等多种类型的细胞。此外，在体内动物实验的研究中，慢病毒也已显示出良好的基因导入效果。

慢病毒技术的流程包括以下几个阶段：(1)慢病毒的载体质粒构建和纯化提取；(2)与辅助质粒共转染293T细胞，收集培养上清；(3)慢病毒颗粒的纯化和浓缩；(4)慢病毒颗粒感染宿主细胞，将目的的DNA片段整合宿主细胞染色体上。

慢病毒技术使用过程中，感染环节是最重要的环节之一。由于慢病毒颗粒制备费用较为昂贵，而直接用慢病毒感染很多细胞在感染效率和整合效率这两个环节都存在效率低下的问题，这个环节通常需要引入慢病毒感染试剂来增强慢病毒的感染效率和整合效率。目前常用的慢病毒感染试剂为溴化己二甲铵，是一种多聚阳离子聚合物，作用机理为中和细胞表面蛋白与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。该试剂存在两个方面不足：一是对很多细胞存在较大细胞毒性，限制了该试剂的使用范围，包括浓度范围和细胞使用范围；二是感染效率和整合效率提升一般只有3-10倍，还有很大的改进空间。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种慢病毒感染试剂及其制备方法与应用，以降低慢病毒感染试剂的细胞毒性，提高感染效率和整合效率，扩展感染试剂的使用范围，降低制备成本。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明提供了一种慢病毒感染试剂，试剂包括第一组合物和第二组合物；第一组合物包括二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺(L-α-Phosphatidyl-ethanolamine-dioleoyl)；第二组合物包括聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物；第一组合物和第二组合物分别独立包装。需要说明的是，本发明采用的L-α-Phosphatidyl-ethanolamine-dioleoyl的购自西格玛奥德里奇公司，本发明采用的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物是购买自西格玛奥德里奇公司F127型号的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物。

优选地，第一组合物包括浓度为1-200mg/ml的二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺溶液。

优选地，第二组合物包括浓度为5-500mg/ml的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物溶液。

本发明还提供了慢病毒感染试剂的制备方法，第一组合物的制备方法包括步骤：将水和二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺混合，然后过滤除菌，配制得到浓度为1-200mg/ml的二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺溶液，4℃保存备用；其中，水为无菌水；第二组合物的制备方法包括步骤：将水和聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物混合，然后过滤除菌，配制得到浓度为5-500mg/ml的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物溶液，4℃保存备用；其中，水为无菌水。需要说明的是，过滤除菌优选采用0.22μm孔径过滤器过滤除菌。

本发明还保护慢病毒感染试剂在慢病毒技术中的应用。