[发明专利]一种mRNA 3’末端混合建库的反转录引物及其用途

说明书

本发明涉及一种mRNA 3’末端混合建库的反转录引物及其用途。利用本发明的反转录引物，以总RNA为起始进行文库构建，能够改进现有技术中的测序数据质量低的问题，并实现低成本mRNA 3’末端混合建库。本发明的反转录引物对于动物和植物群体转录组的研究具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种mRNA 3’末端混合建库的反转录引物及其用途。

背景技术

随着新一代高通量测序技术的快速发展，转录组测序(RNA-seq)已经成为研究转录组与基因表达的重要手段。然而，常规转录组研究技术主要存在以下问题：基因表达定量不准确、建库和测序价格高。

为了解决上述问题，目前已经开发了mRNA 3’末端测序技术，该技术提高了基因表达定量的敏感性和准确性。目前Lexogen公司的mRNA 3’末端建库试剂盒最多能混合96个样本(Lexogen，https：//www.lexogen.com/quantseq-3mrna-sequencing/#quantseqworkflow)，可以进行96个样本的自动化建库，该试剂盒省去了mRNA分离的复杂操作，前期操作简单成本低，但后期96个样本需要平行独立进行建库操作，而且该产品只有96个双端Index，上机时每条Lane最多只能混合96个样本，不适合目前Novoseq测序仪一条Lane需要混合大量样本产出800G以上数据的需求，不适合大规模群体文库构建。

为了进一步提高混合建库的通量和降低文库构建成本，2017年，Bush等(PLATE-Seq for genome-wide regulatory network analysis of high-throughput screens，Bush，E.C et al.，Nature Communications，8，DOI：10.1038/s41467-017-00136-z，2017)建立了转录组表达合并文库扩增(PLATE-seq)技术，该技术使建库工作量大大降低，可在一定程度上降低建库成本，然而，PLATE-seq文库进行测序时，测序读段(reads)R1端样本标签Barcode序列以后的碱基质量很差，基本无法用于后续的数据分析。为避免数据浪费，Bush等只将测序读段(reads)R1端测了26bp以读取Barcode序列区分样本，后续分析全部使用测序读段(reads)R2端序列。因此，该方法构建的文库只能使用定制化的测序流程进行测序，如果采用目前反应次数固定的测序试剂盒，进行标准的双端150/100bp测序，测序读段(reads)R1端除barcode以外的碱基基本不能用于后续分析。

此外，本领域已知，Lexogen的Mrna 3’末端测序试剂盒市场价格约为260元/样本，PLATE-seq建库成本约为200元/样本，与常规转录组文库构建价格相比，尽管这两种建库方法的建库成本已经显著降低，但对于大量群体样本的高通量文库构建来讲，这两种建库方法的成本仍然偏高。

因此，对于基因表达定量准确并且建库成本低通量高的建库技术，目前在本领域中还存在着需求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种mRNA 3’末端混合建库的反转录引物以及混合建库的方法。

根据本发明的一个目的，提供了一种mRNA 3’末端混合建库的反转录引物，所述反转录引物包含VN碱基。

在一个实施方式中，所述反转录引物为96个mRNA的反转录引物。

在一个实施方式中，所述反转录引物选自表1所示的反转录引物：

表1

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