[发明专利]早期胚胎停育绒毛组织miRNAs生物标志物及其表达量的检测方法

权利要求书

1.早期胚胎停育绒毛组织miRNAs生物标志物，其特征在于包括hsa-miR-136-5p、hsa-miR-1301-3p、hsa-miR-135b-5p、hsa-141-3p、hsa-miR-19b-3p以及hsa-iR-486-5p，它们分别为序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。

2.权利要求1所述的早期胚胎停育绒毛组织miRNAs生物标志物在制备诊断或者辅助诊断早期胚胎停育的试剂、试剂盒或生物芯片中的应用。

3.以权利要求1所述早期胚胎停育绒毛组织miRNAs生物标志物为目标设计的引物，其特征在于包括序列表SEQ.ID.No.7至SEQ.ID.No.14的碱基序列。

4.权利要求3所述的引物在制备诊断或者辅助诊断早期胚胎停育的试剂、试剂盒或生物芯片中的应用。

5.权利要求1所述早期胚胎停育绒毛组织miRNAs生物标志物表达量的非诊断目的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)总RNA提取

取绒毛组织加入液氮后研磨成粉末，取50-100mg研磨粉末放入2mL离心管中，同时加入1mL TRIZOL使其充分裂解，室温静置5分钟后，加入200μL氯仿，漩涡混匀15秒，冰上静置15分钟；4℃12000g离心15分钟；吸取上层水相，加入预冷的等体积异丙醇，轻轻混匀，冰上静置10分钟；4℃12000g离心10分钟，弃上清；加入10mL预冷的用DEPC处理过的水配置的75％乙醇，小心重悬沉淀，4℃12000g离心10分钟，弃上清；重复洗涤沉淀；吸出上清，置于超净工作台中风干沉淀5-10分钟；最后加入20μL用DEPC处理过的双蒸水；

(2)去除总RNA中的基因组DNA

采用去除基因组DNA的试剂盒进行，反应体系包括0.4μL 2U/μL DNase I、2μL 10*的反应缓冲液、0.6μL 20U/μL RiboLock RNase Inhibitior,每个反应体系中加入4μg总RNA，总反应体系为20μL；反应条件为：37℃反应30分钟，而后75℃灭活10分钟；

(3)逆转录

采用逆转录试剂盒以及miRNAs特异性茎环结构逆转录随机引物进行miRNAs的逆转录反应；其中反应体系包括0.5μL逆转录随机引物、2μL 5*的逆转录缓冲液、1μL 10mmol/L的dNTP混合物、0.5μL 20U/μL RiboLock RNase Inhibitior、0.5μL 200U/μL逆转录酶，每个反应体系中加入1μg已去除基因DNA的RNA，总反应体系为10μL；反应条件为65℃孵育5分钟立即放冰上5分钟，而后42℃反应60分钟，最后70℃孵育5分钟；

(4)实时荧光定量PCR

5μL 2*的SYBR Green混合液、0.05μL ROX、1.4μL miRNAs引物混合液、1μL稀释后的cDNA、2.55μL双蒸水，总反应体系为10μL，每个miRNA的检测实施4个平行重复；使用快速实时荧光定量PCR仪进行检测，仪器运行的反应条件为：95℃2分钟、95℃5秒、60℃30秒，进行40个循环。

6.根据权利要求5所述早期胚胎停育绒毛组织miRNAs生物标志物表达量的非诊断目的检测方法，其特征在于：步骤(3)中的逆转录随机引物为序列表SEQ.ID.No.14的碱基序列，步骤(4)中引物混合液包括序列表SEQ.ID.No.7至SEQ.ID.No.13的碱基序列。