[发明专利]利用抑制性tRNA系统制备PTC稳定细胞系及应用

权利要求书

1.经改造的抑制性tRNA(stRNA)，其特征在于，所述stRNA来源于真核生物，所述stRNA识别提前终止密码子，所述stRNA能够携带天然氨基酸。

2.如权利要求1所述的stRNA，其中所述stRNA的基因选自SEQ ID NO:1-20所示的序列。

3.翻译系统，其包含氨酰tRNA合成酶和权利要求1或2所述的stRNA，其中氨酰tRNA合成酶和stRNA的基因位于同一载体上。

4.如权利要求3所述的翻译系统，其还包含真核细胞；在一个实施方案中，真核细胞选自293T、BHK-21、MDCK、RD、Vero或CHO细胞。

5.真核细胞，其包含氨酰tRNA合成酶和权利要求1或2所述的stRNA，其中氨酰tRNA合成酶和stRNA的基因以位于同一载体的方式导入所述真核细胞；在一个实施方案中，真核细胞选自293T、BHK-21、MDCK、RD、Vero或CHO细胞。

6.制备如权利要求5所述的真核细胞的方法，其包括:

(1)在载体上分别连接318种单拷贝抑制性tRNA并检测其通读效率，从中确定20种氨基酸分别对应的通读效率最高的抑制性tRNA；

(2)将(1)中确定的20种抑制性tRNA的序列，分别设计20种多拷贝串联抑制性tRNA片段，并将此片段和突变的荧光蛋白，获得20种同时含有报告基因、抗性基因以及高通读效率的多拷贝串联抑制性tRNA载体；

(3)将(2)中所述的抑制性tRNA载体，转导真核细胞，用抗生素筛选，挑取带有荧光的单克隆，并扩大培养，最终得到稳定细胞系，获得整合了突变型绿色荧光蛋白报告基因和多拷贝stRNA的稳定细胞系。

7.利用如权利要求5所述的真核细胞制备含有复制缺陷型(PTC)病毒疫苗方法，包括步骤:

(1)在病毒目的蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个氨基酸位点；

(2)在编码(1)所述的目的蛋白的核酸分子中将(1)中所选择的位点的氨基酸的密码子突变为终止密码子UAG、UAA或UGA；

(3)将(2)中得到的突变的核酸与合适的载体可操作地连接，得到核酸的表达载体；

(4)将(3)得到的突变的核酸的表达载体转染权利要求5所述的真核细胞，将转染成功后的宿主细胞在培养基中培养，在适当的时间收集病毒；

(5)检测病毒的包装滴度和活性。

8.使用如权利要求7所述的方法制备的含有定点突变的病毒。

9.含有有效量的权利要求8所述的定点突变的病毒的组合物。

10.含有有效量的权利要求8所述的定点突变的病毒的疫苗。

11.药物组合物，其中含有有效量的权利要求8所述的定点突变的病毒，以及药学上可以接受的赋形剂。

12.权利要求8所述的定点突变的病毒在制备减毒活疫苗、制备预防和治疗病毒感染相关药物中的用途。

13.权利要求8所述的定点突变的病毒在预防和治疗感染中的用途。