[发明专利]利用抑制性tRNA系统制备PTC稳定细胞系及应用

说明书

本发明属于生物制药领域，具体涉及抑制性tRNA调控提前终止密码子(PTC)通读的稳定细胞系制备方法及应用。本发明主要涉及构筑20种对应三种终止密码子的抑制性tRNA，利用20种抑制性tRNA通读提前终止密码子(PTC，UAG/UAA/UGA)。本发明还涉及串联多拷贝正交tRNA的质粒载体的构建方法，以及借助线性化质粒、慢病毒或Tol2转座子系统将串联的抑制性tRNA基因稳定整合到细胞基因组的方法。本发明进一步涉及稳定细胞系的应用，如包装复制缺陷型(PTC)病毒疫苗。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及抑制性tRNA调控提前终止密码子(Prematuretermination codons，PTC)通读的稳定细胞系制备方法及应用。本发明主要涉及构筑20种对应三种终止密码子的抑制性tRNA，利用20种抑制性tRNA通读提前终止密码子(PTC，UAG/UAA/UGA)。本发明还涉及串联多拷贝正交tRNA的质粒载体的构建方法，以及借助线性化质粒、慢病毒或Tol2转座子系统将串联的抑制性tRNA基因稳定整合到细胞基因组的方法。本发明进一步涉及稳定细胞系的应用，如包装复制缺陷型(PTC)病毒疫苗。

背景技术

抑制性tRNA通读无义突变

人类基因组中的61种密码子可以被tRNA识别，编码20种氨基酸，三种终止密码子(UAG、UAA、UGA)没有相应的tRNA识别，不编码氨基酸，进而终止翻译。但是有研究发现，存在可以识别终止密码子的tRNA，使终止密码子编码氨基酸，蛋白翻译正常进行。这种能够识别终止密码子的tRNA，即为无义突变抑制性tRNA。抑制性tRNA存在广泛，无论在植物细胞还是动物细胞中，都发现了抑制性tRNA。但由于抑制性tRNA在细胞中含量极少，因此抑制性tRNA不易被检测到。

无义突变抑制性tRNA由正常编码氨基酸tRNA反密码子环碱基突变产生，突变后的tRNA能识别终止密码子并与终止密码子完全互补配对，同时仍能携带天然氨基酸，能够在提前终止密码子处插入特定氨基酸，通读无义突变。基于抑制性tRNA能够通读无义突变的特性，有文献报道应用抑制性tRNA通读原核和真核细胞中含有提前终止密码子的蛋白，恢复蛋白表达。另外，虽然抑制性tRNA能够恢复含无义突变蛋白表达，但不同抑制性tRNA通读效率有较大差异。因此，需找高效抑制性tRNA，构建多种稳定表达高效通读终止密码子的抑制性tRNA的细胞系，比较在哺乳动物细胞中通读效率差异尤为重要。

PTC技术及其应用瓶颈

经过数年的研究，人们对原核生物核糖体的翻译机制已有较全面的理解，多种核糖体不同功能状态的晶体和电镜结构已得到解析，大多数氨酰tRNA合成酶的结构也已获得。基于这些研究成果，近年来发展起来了遗传密码子扩展的技术——在基因组中引入琥珀终止密码子(TAG)，利用外源非天然氨基酸生物正交翻译系统来编码多种非天然氨基酸，并在生物活体内将其定点插入。到目前为止，这一技术已经将数种非天然氨基酸(包括亲和标记和光致异构化的氨基酸、羰基氨基酸和糖基化氨基酸)成功地定点表达在活细胞的蛋白质当中，赋予了这些蛋白质新颖的物理、化学和生理性质(L.Wang等，2001，Science 292:498-500；J.W.Chin等，2002，Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J.W.Chin，&P.G.Schultz，2002，ChemBioChem 11:1135-1137)。这些研究表明，该技术可以有选择性将羰基、炔基和叠氮基团等特殊化学基团引入蛋白质中，实现蛋白质的定点特异修饰，改善蛋白质的性质。同时，该技术还可应用在活体生物体(如病毒、细菌等)的定点标记、定点修饰、复制的控制等方面(Si L等，2016，Science 354:1170-1173)。