[发明专利]一种激活内源性Ngn3和MAFA基因表达的方法

权利要求书

1.一种激活靶细胞中内源性Ngn3基因和/或MAFA基因表达的方法，是基于CRISPRa的SAM系统建立激活靶细胞中内源性Ngn3基因和/或MAFA基因表达的方法；

所述SAM系统包括靶向Ngn3基因和/或MAFA基因转录起始点上游-400至+1 bp位置的sgRNA；

针对Ngn3基因的所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3；

针对MAFA基因的所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.6和SEQ ID No.10。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：使所述靶细胞表达dCAS-VP64融合蛋白、MS2-P65-HSF1融合蛋白和所述sgRNA，从而激活所述靶细胞中内源性Ngn3基因和/或MAFA基因表达。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

（1）包装能够表达所述dCAS-VP64融合蛋白的重组慢病毒A；包装能够表达所述MS2-P65-HSF1融合蛋白的重组慢病毒B；然后将所述重组慢病毒A和所述重组慢病毒B一起感染所述靶细胞，得到阳性细胞系；

（2）向步骤（1）所得阳性细胞系中导入能够表达所述sgRNA的载体，进而实现激活所述靶细胞中内源性Ngn3基因和/或MAFA基因表达。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，包装所述重组慢病毒A时，采用的目的质粒是lenti dCAS-VP64_Blast载体；包装所述重组慢病毒B时，采用的目的质粒是lenti MS2-P65-HSF1_Hygro 载体。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，包装所述重组慢病毒A和所述重组慢病毒B时，采用的包装细胞均为293T细胞。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，针对Ngn3基因的能够表达所述sgRNA的载体为载体A和载体B；

所述载体A为将通过BsmB I酶切位点向lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone中插入SEQID No.2所示DNA片段后得到的重组载体；

所述载体B为将通过BsmB I酶切位点向lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone中插入SEQID No.3所示DNA片段后得到的重组载体。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，针对MAFA基因的能够表达所述sgRNA的载体为载体C和载体D；

所述载体C为将通过BsmB I酶切位点向lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone中插入SEQID No.6所示DNA片段后得到的重组载体；

所述载体D为将通过BsmB I酶切位点向lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone中插入SEQID No.10所示DNA片段后得到的重组载体。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述靶细胞为293T细胞或多能干细胞。

9.一种制备内源性Ngn3基因和/或MAFA基因表达被激活的细胞的方法，包括如下步骤：利用权利要求1-8中任一所述的方法制备得到内源性Ngn3基因和/或MAFA基因表达被激活的细胞。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述细胞为293T细胞或多能干细胞。

11.sgRNA，为靶向Ngn3基因和/或MAFA基因转录起始点上游-400至+1 bp位置的sgRNA；

针对Ngn3基因的所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3；

针对MAFA基因的所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.6和SEQ ID No.10。