[发明专利]一种激活内源性Ngn3和MAFA基因表达的方法

说明书

本发明公开了一种激活内源性Ngn3和MAFA基因表达的方法。本发明方法基于CRISPRa的SAM系统建立激活靶细胞中内源性Ngn3和/或MAFA基因表达。所述SAM系统包括靶向Ngn3和/或MAFA基因转录起始点上游‑400至+1bp位置的sgRNA；针对Ngn3的sgRNA的靶序列为SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3；针对MAFA的sgRNA的靶序列为SEQ ID No.6和/或SEQ ID No.10。本发明应用CRISPRa技术，通过染色质重塑，能高效地激活293T细胞的Ngn3和MAFA表达。本发明将对基因诱导PSCs定向分化为β细胞以及胰腺的胚胎发育研究具重要作用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种激活内源性Ngn3和MAFA基因表达的方法。

背景技术

糖尿病的发病率正在逐年显著增加，是影响人类健康的主要疾病之一。目前，胰岛β细胞移植被认为是治疗糖尿病最有效的办法之一。然而，大规模胰岛β细胞移植的应用却受到细胞来源短缺和终生使用免疫抑制剂等限制[Atkinson,M.A.Eisenbarth,G.S.Type1diabetes:new perspectives on disease pathogenesis and treatment.Lancet 358,221-229,doi:10.1016/S0140-6736(01)05415-0(2001).]。因此，寻找β细胞替代资源成为糖尿病细胞治疗迫切需要解决的问题，具有重要的经济价值和广泛的社会意义。

由多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)定向分化为胰岛β细胞和非胰岛β细胞转分化是体外获得β细胞的一个重要研究领域[Miyazaki,S.,Yamato,E.Miyazaki,J.Regulated expression of pdx-1promotes in vitro differentiation of insulin-producing cells from embryonic stem cells.Diabetes 53,1030-1037(2004).]。过表达胰腺发育过程的关键性转录因子诱导细胞分化与转分化，是体外获得β细胞的一个重要策略。然而，常规的基因表达方法如各种病毒、脂质体、电转以及mRNA等方法很难有效地激活内源性基因的表达[Miyazaki,S.,Yamato,E.Miyazaki,J.Regulated expression ofpdx-1promotes in vitro differentiation of insulin-producing cells fromembryonic stem cells.Diabetes 53,1030-1037(2004).]，因此，体外获得的β细胞不具有成熟的生理功能。