[发明专利]一种草鱼出血病口服型疫苗及其制备与用途

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种草鱼出血病口服型疫苗及其制备与用途。本发明首先提供一种融合蛋白，含有枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC和草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白，所述草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白的氨基酸序列对应于如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列。采用所述融合蛋白制备成的口服疫苗，具有制备工艺简单、成本低，口服疫苗方便使用等优点，同时避免注射免疫方案中捕捞鱼和注射对鱼体的损伤。且较已有疫苗对鱼体抵抗草鱼出血病具有更好免疫保护效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种草鱼出血病口服型疫苗及其制备与用途。

背景技术

草鱼出血病(Grass Carp Hemorrhage)是一种由草鱼呼肠孤病毒(Grass carpreovirus，GCRV)引起的危害草鱼养殖的病毒性传染病，主要引起患病草鱼鱼种各器官、组织不同程度的充血、出血症状，并因此得名。1970年首次发现，此后相继在我国湖北、湖南、广东、广西、江苏、浙江、安徽、福建、上海、四川等省、市、自治区各养殖区流行，还可感染青鱼、鲫鱼、麦穗鱼等多种鱼种。由于草鱼出血病危害鱼类种类多，流行范围广，发病季节长(每年6月下旬到9月底为主要流行季节)，死亡率高达85％，对水产养殖带来巨大危害和经济损失。

GCRV隶属水生呼肠孤病毒属(Aquareoviridae，AQRV)，是中国分离的第一种鱼类病毒，也是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株。GCRV病毒属于AQRV的C群，为二十面体对称的球形体，成熟病毒直径为70-80nm，具有双层衣壳，无囊膜，基因组由11条dsRNA组成。主要通过呼吸道感染宿主，具有高度传染性和致死性。GCRV主要危害10cm左右的草鱼鱼种(4-5月龄)，通过鱼鳃进入鱼体，前3天为潜伏期，第四天后开始发病，侵染草鱼肝脏、肾脏、肠道、肌肉等组织，5-7天后出现明显充血、出血症状。

目前，免疫接种仍是防治该病毒性疾病最有效的途径，包括灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗、DNA疫苗等。蛋白酶抑制剂、RNA干扰技术、免疫增强剂也取得一定的进展和应用。譬如，中国水产科学研究院珠江水产研究所通过多代培养、减毒研制的弱毒活疫苗已实现商品化并得到广泛应用，使草鱼出血病在一定程度上得到了控制。近年来，基因工程制备亚单位疫苗和核酸疫苗为综合防治草鱼出血病提供了新方法。亚单位疫苗具有滴度高、抗体出现早、持续时间长等优点，具有胸腺依赖性免疫原的性质。核酸疫苗也称基因疫苗，以其抗原性强、改造方便、保护时间长、制备和运输方便而越来越受到人们的重视。贡成良等也构建了带有草鱼出血病病毒结构蛋白VP6基因的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6并接种至五龄家蚕幼虫或蛹，再将五龄家蚕幼虫或蛹冷冻干燥制备的冻干粉与鱼饲料均匀混合获得口服疫苗。

枯草芽孢作为口服型疫苗载体，具有很多常规疫苗载体不可比拟的优点：它属于革兰阳性菌，不产生毒素，生物安全性高，稳定性极好，是常用的益生菌之一，已用作为人的功能性食品、动物饲料添加剂等。此外，枯草芽孢有独特的免疫学特性，口服的芽孢在动物肠道能被肠道相关淋巴组织识别，发挥免疫佐剂作用，活化肠粘膜上的淋巴组织，增加分泌型(sIgA)抗体分泌，提高免疫识别能力，并诱导T、B淋巴细胞和巨噬细胞分泌细胞因子，通过淋巴细胞再循环活化全身免疫系统，从而增强机体的非特异性和特异性免疫系统。

枯草芽孢杆菌有完善的分泌系统，能将外源重组蛋白直接分泌至培养液中，大大减少了表达产物的分离纯化步骤，已应用于许多重组蛋白的表达。枯草芽孢杆菌芽孢生产成本低，生长快速，对营养要求低，适于现代工业发酵生产。生产的重组芽孢疫苗，稳定性高，方便储存、运输，并可以作为食品添加剂使用。因此枯草芽孢杆菌已作为益生菌得到广泛应用畜牧业和渔产业，特别是作为添加剂，不仅克服了抗生素对消化道内其它微生物菌群的不良影响，而且避免了抗生素长期使用的毒副作用、抗药性和耐药性，并能促进禽畜及鱼类的生长，增强动物防病抗病能力，提高饲料的消化、吸收利用率和转化率，提高养殖业产量。由于枯草芽孢作为疫苗载体所具有独特优势，被认为是最有前景的口服疫苗载体并开始应用于病原微生物疫苗的研制。