[发明专利]一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用

说明书

本发明涉及植物抗病毒基因工程领域，公开了一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用。高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段包括TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段中的至少一种，TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段的核苷酸序列分别如Seq ID No.13、Seq ID No.14、Seq ID No.15所示，所述基因片段在接种寄生植物后可高效产生siRNA。弱毒疫苗以TVBMV弱毒突变体为基础，TVBMV弱毒突变体中嵌入了可诱导对烟草花叶病毒产生交叉保护的有效基因片段，所述的有效基因片段包括可产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段。本发明的抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗作用稳定，可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受烟草花叶病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。

技术领域

本发明属于植物抗病毒基因工程领域，具体地说，涉及一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用。

背景技术

病毒病是作物上的重要病害，给农业生产造成巨大损失。由于作物病毒病种类多，传播途径复杂，生产上没有免疫或高抗病毒病的品种，市场上又没有对病毒病特效的药剂，因而病毒病的防治非常困难。

烟草病毒病一直是制约我国烟叶生产的重要因素。目前生产上的烟草主栽品种对病毒病的抗性都不理想，烟草病毒病的防治主要依赖农业防治和化学防治。但生产中没有针对病毒病的特效药剂，通过杀灭传毒昆虫来防治烟草病毒病的效果很差，而且农药的大量应用也不符合烟叶生产可持续发展的要求。利用弱毒株系保护植物免受强毒株系的侵染和危害(交叉保护)是防治病毒病非常有效的手段，在许多作物病毒病的防治中取得了成功。最近几年，交叉保护受到了越来越多的关注。

植物可利用RNA沉默来抵抗病毒侵染，病毒侵染植物后会产生大量病毒来源的小RNA(virus-derived small interfering RNAs,vsiRNA)，介导对病毒RNA的降解或抑制病毒基因的转录。交叉保护是指植株受弱毒株系侵染后，免受后继的病毒强毒株系侵染的现象，已经在许多作物病毒病的防治中取得了成功。而限制交叉保护广泛应用的关键因素是一是目前可用的弱毒株系种类不多，应用不方便，二是已发现的弱毒株系都是自然存在或人工诱变产生的，可能只在个别甚至是一个氨基酸位点发生了突变。这些弱毒株系或突变体在用于防治病毒病时有突变为强毒株系的风险。

烟草花叶病毒(TMV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，分布范围和寄主范围均十分广泛，能侵染烟草、番茄、马铃薯等茄科作物，形成疱斑或花叶症状，严重影响作物产量及品质。TMV与黄瓜花叶病毒间有协生作用，一旦复合侵染会引起严重症状，造成更大损失。

田颖川、方荣祥报道获得转基因抗TMV工程植株，田波、陈章良也分别把从TMV-CP基因及卫星RNA导入到烟草品种NC89、C-28中，创造出抗TMV的转基因烟草，但因为转基因烟草受限而不能推广种植。杨恭、邵碧英筛选到TMV弱毒株系N14、TMV-152，并开发成弱毒疫苗，但因为接种和扩繁不便未能推广使用。因此，急需能够起到有效交叉保护作用的稳定的弱毒疫苗来防治植物的病毒病。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用。本发明获得了序列保守且能够高效脱靶产生siRNA的TMV片段，抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗作用稳定，可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受烟草花叶病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：