[发明专利]一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用

权利要求书

1.一种三维矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)I型胶原的提取：称取1kg的牛肌腱用碎肉机切碎并清洗过后，加入大量的丙酮浸泡1天去除表面脂肪组织；常温干燥后加入2L的0.5M的乙酸溶液在4℃下搅拌1天，向体系中加入100g的胃蛋白酶继续搅拌2天并不断补充新的乙酸溶液直至总体积为5L；将混合物用纱布粗滤，得到的滤液为胶原粗提物；在粗提物中加入NaCl进行盐析，分离出沉淀再用0.5M的乙酸溶液溶解，反复三次后将所得溶液置于透析袋中进行透析，最后冷冻干燥得到高纯I型胶原；

2)纳米羟基磷灰石的制备：将66mg的CaCl₂·2H₂O及25mg的聚丙烯酸溶于50mL的TBS缓冲液中得到A液；将48mg的K₂HPO₄·3H₂O加入到50mL的TBS缓冲液中得到B液；在40℃水浴中将A液逐滴滴加到B液中；反应完成后在该混合液中加入大量无水乙醇，8000～12000r/min离心5～10分钟，去掉上清液，在羟基磷灰石沉淀中加入50mL的灭菌PBS溶液，使其pH＝7.4，震荡使其完全溶解；

3)胶原矿化：取一定量的I型胶原溶于0.5M的乙酸溶液中，并放入截留分子量为10000的透析袋中，并将透析袋置于步骤2)所得的羟基磷灰石的PBS溶液中；在湿润的环境中于37℃下透析六天，每三天换一次羟基磷灰石的PBS溶液，随后在去离子水中透析三天进行清洗去掉多余的盐，每天换一次水；

4)三维多孔框架的合成：将步骤3)得到的矿化胶原离心、搅拌形成一种可铸形的悬浮液，注入到圆柱形或长方形的模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架；为确保稳定的微环境，再使用含有1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺及N-羟基丁二酰亚胺的混合液交联20小时，随后用甘氨酸溶液与去离子水交替冲洗，冻干，即得到具严格等级结构的三维矿化胶原支架。

2.根据权利要求1所述的三维矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，根据中间体自由能的计算得出聚丙烯酸的分子量区间在1720～2265之间。

3.根据权利要求1所述的三维矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，TBS缓冲液的配制方法为：2.42g的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和8g的NaCl溶于1L的去离子水中，最后用HCl调节溶液pH为7.4。

4.根据权利要求1所述的三维矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所述的I型胶原的浓度为0.1～10mg/mL。

5.如权利要求1-4任一项所述的三维矿化胶原支架材料的制备方法得到的具严格等级结构的三维矿化胶原支架。

6.如权利要求5所述的具严格等级结构的三维矿化胶原支架在制备骨组织修复材料中的应用。