[发明专利]一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用

说明书

本发明公开了一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用，通过二元组装制备具严格等级结构的三维矿化胶原支架材料的方法分为两步：首先制备纳米羟基磷灰石；在胶原矿化过程中通过透析缓慢进入并沉积于胶原纤维表面；在体外通过各项参数的控制完成对天然骨矿化胶原纤维的模拟；再完全复制天然骨化学成分及周期性等级结构的前提下，三维矿化胶原支架具有合适的机械强度，能够招募宿主细胞实现成骨分化。具严格等级结构的三维矿化胶原支架材料还具备优良的成血管能力，不加任何生物制剂如成骨因子或重组蛋白的情况下，单独利用三维多孔胶原支架材料实现活体动物试验中骨缺损的修复。

技术领域

本发明涉及骨组织修复材料制备与治疗领域，具体是一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用。

背景技术

传统意义上通常以生物材料结合成骨细胞及成骨蛋白为一种强有力的手段来修复骨缺损，这种方法的缺点是高成本和伴随着外源性细胞和生长因子带来的副作用，如呼吸效应、异位骨形成、移植点的原位骨吸收，及可能导致的癌症发病率增高等。因此开发利用身体自主再生能力，通过召集宿主细胞来诱导骨形成的骨诱导型生物材料仍然是临床亟待解决的问题。而这项技术的关键在于发展一种目标特异性的生物支架材料以模拟天然骨的等级结构和表面形貌为招募宿主细胞提供合适的微环境，最终完成从结构到功能上的骨再生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种三维矿化胶原支架材料的制备方法，包括以下步骤：

1)I型胶原的提取：称取1kg的牛肌腱用碎肉机切碎并清洗过后，加入大量的丙酮浸泡1天去除表面脂肪组织；常温干燥后加入2L的0.5M的乙酸溶液在4℃下搅拌1天，向体系中加入100g的胃蛋白酶继续搅拌2天并不断补充新的乙酸溶液直至总体积为5L；将混合物用纱布粗滤，得到的滤液为胶原粗提物；在粗提物中加入NaCl进行盐析，分离出沉淀再用0.5M的乙酸溶液溶解，反复三次后将所得溶液置于透析袋中进行透析，最后冷冻干燥得到高纯I型胶原；

2)纳米羟基磷灰石的制备：将66mg的CaCl₂·2H₂O及25mg的聚丙烯酸溶于50mL的TBS缓冲液中得到A液；将48mg的K₂HPO₄·3H₂O加入到50mL的TBS缓冲液中得到B液；在40℃水浴中将A液逐滴滴加到B液中；反应完成后在该混合液中加入大量无水乙醇，8000～12000r/min离心5～10分钟，去掉上清液，在羟基磷灰石沉淀中加入50mL的灭菌PBS溶液，使其pH＝7.4，震荡使其完全溶解；

3)胶原矿化：取一定量的I型胶原溶于0.5M的乙酸溶液中，并放入截留分子量为10000的透析袋中，并将透析袋置于步骤2)所得的羟基磷灰石的PBS溶液中；在湿润的环境中于37℃下透析六天，每三天换一次羟基磷灰石的PBS溶液，随后在去离子水中透析三天进行清洗去掉多余的盐，每天换一次水；

4)三维多孔框架的合成：将步骤3)得到的矿化胶原离心、搅拌形成一种可铸形的悬浮液，注入到圆柱形或长方形的模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架；为确保稳定的微环境，再使用含有1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺及N-羟基丁二酰亚胺的混合液交联20小时，随后用甘氨酸溶液与去离子水交替冲洗，冻干，即得到具严格等级结构的三维矿化胶原支架。

作为本发明进一步的方案：在步骤2)中，根据中间体自由能的计算得出聚丙烯酸的分子量区间在1720～2265之间。

作为本发明进一步的方案：在步骤2)中，TBS缓冲液的配制方法为：2.42g的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和8g的NaCl溶于1L的去离子水中，最后用HCl调节溶液pH为7.4。