[发明专利]一种检测RYR1基因多态性的多重基因检测试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开了一种检测RYR1基因多态性的多重基因检测试剂盒及其使用方法。本发明采用两管以上多重PCR结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的RYR1基因35个单核苷酸多态性(SNP)位点。试剂盒组成：用于扩增所述35个SNP位点及内参的4管引物组合物、PCR反应液、4管阳性对照液和无核酸酶水。试剂盒使用方法：(1)采集样本提取核酸，或采集口腔脱落细胞于细胞采集卡上；(2)采用步骤1所述细胞采集卡或提取的核酸为模板进行多重PCR扩增；(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离35个SNP位点；(4)结果分析判读。本发明的优势是灵敏度高、特异性强、通量高、成本低，能快速同步检测多个SNP位点，克服了传统方法存在的缺陷。

技术领域

本发明涉及一种多重基因检测试剂盒，尤其是涉及一种同步检测RYR1基因35个单核苷酸多态性的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

恶性高热(Malignant Hyperthermia，MH)是目前所知的唯一可由常规麻醉用药引起手术死亡的遗传性疾病。在全麻过程中，挥发性吸入麻醉药和去极化肌松药-琥珀胆碱可引起的骨骼肌异常高代谢状态，患者出现高热、酸中毒、低氧血症、高血钾、心律失常等一系列变化，一旦发病，病情发展迅速，在没有特效拮抗药丹曲林的情况下，一般临床措施难以控制病情，最终病人可因器官功能衰竭而死亡。恶性高热在普通人群中的发病率为1/10000～1/250000。由于临床上遇到恶性高热，往往都没有做好预防措施，治疗不及时，致死率高达70％～90％。若患者及时接收治疗并使用特效药丹曲林，致死率可降低到10％以内。

MH作为一种常染色体显性遗传病，研究证实至少有5个基因的异常与其发生有关，但已明确的致病基因仅为罗纳丹受体(Ryanodine receptor，RYR1)和编码二氢吡啶受体α1亚单位的CACNA1S(L type voltage-dependent calcium channel，L型电压门控Ca²⁺通道)。2017年8月EMHG公布，目前已确认35个单核苷酸突变体(SNP)可以作为恶性高热易感性的最重要判断依据，包括RYR1的35个单核苷酸突变体。因此，对于采用全麻麻醉的手术患者，术前筛查恶性高热易感性，可帮助医生调整麻醉方案，有效避免恶性高热发生。

目前，国际上公认咖啡因-氟烷体外肌挛缩试验(CHCT)是确诊MH易感性的金标准。CHCT价格昂贵，局限于专业测试中心使用，需要外科手术切取患者一块肌肉，创伤性较大，且不容易区分假阳性和假阴性结果，在某种程度上限制了其广泛应用。通过检测与恶性高热相关的RYR1基因SNP位点判断恶性高热易感性，操作方便，成本较低，是一种可行性较高的检测方案。

现有的SNP位点检测方法主要有三种：荧光定量PCR、基因芯片技术、测序法。现简述如下：

1、荧光定量PCR：采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点设计特异性的探针。其优点是灵敏度高、准确性强；其缺点：

(1)通量低，如同时检测35个SNP位点，需要一个一个位点检测，耗时长，样品用量大，难以适应临床需求；

(2)难以设置内参质控，无法避免假阳性和假阴性；

(3)探针标记成本高。

2、基因芯片技术：

基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。其优点是通量高、操作简便；缺点是检测成本昂贵、重复性差、灵敏度较低。此外，芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准也限制了基因芯片技术的普及。

3、测序法：