[发明专利]一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒及其使用方法

说明书

本发明涉及一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒及其使用方法。本发明提供了一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒，所述试剂盒包括核酸分离与纯化试剂，DNA亚硫酸盐转化试剂，KRAS基因突变检测试剂，SDC2和SFRP2基因甲基化检测试剂，粪便隐血检测试剂；其中核酸分离与纯化试剂用于分离及纯化出粪便样本中的人源DNA；DNA亚硫酸盐转化试剂用于将纯化的部分人源DNA进行亚硫酸盐转化，用于后续SDC2和SFRP2基因甲基化水平的检测。本发明检测结直肠癌的灵敏度可达90％以上，特异性85％左右，能够实现结直肠癌的高灵敏度和高特异性检测；本发明能够检测大多数结直肠癌前病变，实现结直肠癌超早期检测，且在用于辅助临床诊断时，可大大降低临床现有方法的漏诊漏检率。

技术领域

本发明属于生物技术及诊断研究领域，更具体的说，它涉及一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒及其使用方法。

背景技术

结直肠癌在世界范围内的发病率和死亡率在所有癌症中分别排名第三位和第四位，每年大概有136万结直肠癌新发病例和69.4万结直肠癌死亡病例。在中国，癌症发病率和死亡率在不断升高，从2010年起，癌症就成了死亡的主要原因。据估计，2015年，中国结直肠癌新发病例达到37.63万，死亡病例达到19.10万，分别排在所有癌症的第五位。结直肠癌主要发生在50岁以上的人群，且年龄越大，患癌风险越高。绝大多数结直肠肿瘤的发展都经历多个阶段，包括一系列组织学、形态学、基因变异的逐渐积累。因此，这就给癌前病变的筛查和检测提供了有利条件，从而实现结直肠癌的超早期检测和早诊早治，降低结直肠癌的发病率和死亡率。

目前有很多结直肠癌筛查方法，它们都具有各自的优势和劣势。比如，肠镜能够实现全结肠的可视化，非常灵敏地检测远端和近端的病变，且在检测的同时去除病变，但它属于侵入性检测，而且需要进行复杂的肠道准备，另外，还伴随肠穿孔以及出血的风险，因此，肠镜检测的依从性比较差。类似的还有乙状结肠镜检查。直肠指检虽然操作简便，但只能了解距肛门8厘米范围内的病变，无法检测肠道远端病变；愈创木脂粪便隐血试验筛查特异性低，存在大量假阳性，且易受含亚铁离子的食物和药物干扰；CEA、CA19-9属于广谱性肿瘤标志物，筛查灵敏度和特异性都不高。

散发性结直肠癌是遗传和表观遗传变异逐渐积累的结果，这些变异累积会导致正常结肠上皮细胞向腺癌转化。研究指出结直肠癌发生过程往往伴随着总体低甲基化以及特定基因启动子区域的超甲基化，这些甲基化水平的变化参与细胞周期调控、DNA修复、细胞凋亡、血管生成、粘附和侵袭。因此，基因甲基化是潜在的结直肠癌标志物，可以用于结直肠癌及癌前病变的筛查。SEPT9甲基化检测是FDA批准的第一个也是唯一的基于血液的结直肠癌筛查方法，进一步证明了基因甲基化用于结直肠癌筛查的有效性。另外，DAVIDA.AHLQUIST开展了一项使用粪便DNA检测结直肠癌和腺瘤的研究。在这项研究中，粪便DNA试验主要检测4个基因(BMP3，NDRG4，TFPI2和波形蛋白)的甲基化水平，KRAS基因突变以及血红蛋白。最终，粪便DNA试验成功检测出85％的结直肠癌患者以及54％的腺瘤(1cm以上)患者，同时特异性高达90％。随后，Thomas F.Imperiale也进行了类似的研究。在研究中，Thomas F.Imperiale主要检测粪便DNA中两个基因(BMP3和NDRG4)的甲基化水平、KRAS突变以及血红蛋白，然后使用这四个肿瘤标志物联合筛查结直肠癌以及癌前病变，同时还比较了这种方法和FIT筛查结直肠癌和癌前病变的效果。该研究总共募集了9989位志愿者，其中包括65名结直肠癌患者以及757名高级癌前病变患者。最终结果显示多靶点粪便DNA试验能够检测92.3％的结直肠癌以及42.4％的高级癌前病变，同时特异性高达86.6％。相比于FIT，多靶点粪便DNA试验检测结直肠癌和癌前病变的效果更好。这项研究表明多靶点粪便DNA试验能够用于在无症状人群中筛查结直肠癌。除了BMP3和NDRG4基因甲基化，粪便DNA中SDC2和SFRP2基因甲基化也能够有效检测结直肠癌。根据文献报道，粪便DNA中SDC2甲基化检测结直肠癌的灵敏度高达90％，检测小息肉的灵敏度为33.3％，特异性高达90.9％；SFRP2基因甲基化检测结直肠癌的灵敏度为71％，特异性为94％。