[发明专利]一种捕获基因组特定DNA片段的方法

说明书

本发明公开了一种捕获基因组中特定片段DNA的方法，包括以下步骤：(1)将待检测DNA和含有目标位点的sgRNA/基因编辑蛋白复合物结合；切割出特定目标DNA；(2)构建测序文库；(3)测序确定特定区域DNA序列；本发明无需用常规捕获技术的杂交结合，可快速地实现了特定目标区域DNA富集，避免了常规方法杂交富集步骤多、流程繁琐等缺点，检测结果也更精准。

技术领域

本发明涉及一种捕获基因组特定DNA片段，用于后续DNA检测的方法。

背景技术

人的基因组具有30亿个碱基，也就是3Gb，其中含有编码区、非编码区和一些调控区域。随着高通量测序技术的发展，对全基因组进行重测序的成本越来越低，人类第一个基因组花费了30亿美金，现在一个人的全基因组重测序已经在几千人民币，近十年测序成本降低了一万倍，成本降低非常快。然而在临床上，比如特定遗传病检测、携带者筛查、耳聋检测、多基因病检测、单基因病检测，并不是每个病例都需要进行全基因组测序，而只需要进行特定区域的检测，从而快速检测该特定区域是否有DNA水平的结构异常。目前市场上出现了特定片段测序的方法，基本实现的方法有以下三个方向：

1、PCR：PCR反应的核心是通过特定引物和目标DNA在合适温度下的结合，从而在聚合酶的存在下进行扩增。采用PCR技术，对需要检测的片段进行扩增，然后对扩增产物进行测序检测。PCR方法简单方便，价格便宜，快速实现区域富集。该技术适用于几十个位点富集，当需要检测位点比较多的时候，要调整优化每一个PCR反应的引物在一个近似的温度，同时进行反应就会非常困难，因为每个引物区域由特定位点决定，而这些区域的GC含量不尽相同，因此并不适用于大规模的片段检测。

2、RNA探针富集：美国安捷伦公司发布了通过合成RNA探针和基因组DNA杂交从而一次性获得全基因组所有基因外显子区域的技术。该方法的原理是，首先将基因组DNA进行随机破碎，补平、加A、链接接头、扩增6～7个循环，得到一个全基因组小片段的扩增文库，然后将文库DNA变性成单链DNA和全外显子区域互补的RNA探针进行杂交4～16个小时，RNA探针上有生物素标记，通过链霉亲和素标记的磁性颗粒进行结合，从而洗去不是靶标区域的DNA，剩余的DNA进行10～16个循环的PCR扩增得到了最终文库，该文库就可以通过高通量测序进行检测，一般全外显子+调控区域基本在50Mb左右，测序一个2G数据量左右，就可以对外显子和调控区域有全面的检测。该技术出现以后，科研和临床范围应用广泛，目前主要的供应商为安捷伦和罗氏公司。这个方法相较于PCR最大的优点，可以一次性对全部外显子区域进行富集，这是常规PCR、多重PCR技术都无法实现的。该技术也可以针对特定区域进行定制，灵活性也不错。但是该技术操作相较于PCR技术复杂很多，耗时长，需要3～4天，整个实验过程有两次PCR过程，虽然现在基本都采用高保障PCR聚合酶，但是也不排除多次PCR扩增过程中会人为引入碱基错配。

3、DNA探针富集：市场上也有用双链DNA探针和目标区域杂交富集的技术。该技术的实现路线和RNA探针的基本一致，也是首先将基因组DNA进行随机破碎，补平、加A、链接接头、扩增6～7个循环，得到一个全基因组小片段的扩增文库，然后将文库DNA变性成单链DNA和全外显子区域互补的DNA探针进行杂交4～16个小时，探针上有生物素标记，通过链霉亲和素标记的磁性颗粒进行结合，从而洗去不是靶标区域DNA，剩余的DNA进行10～16个循环的PCR扩增得到了最终文库，该文库就可以通过高通量测序进行检测，一般全外显子+调控区域基本在50Mb左右，测序一个2G数据量左右，就可以对外显子和调控区域有全面的检测。相较于PCR技术的优缺点和RNA探针方法一致。相较于RNA探针，具有探针本身稳定较佳，但是和目标片段DNA结合能力上不如RNA。

PCR直接扩增技术通量较低，一般来说基因组捕获都指以探针方式杂交获得的形式。这种技术有几个常见的缺点：1.对于临床开展技术难度大，操作复杂，需要进行严格的分区，不利于该技术的大规模开展；2.当样本量大的时候，样本之间容易交叉污染；3.探针的方法由于需要在65度的温度下探针和目标DNA进行长时间的杂交结合，才能成功获得目标片段，因此耗时长久。