[发明专利]羊乳寡糖测定方法

权利要求书

1.羊乳寡糖测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、对羊乳脱脂、脱蛋白，提取羊乳寡糖粗品；

步骤二、对所述羊乳寡糖粗品利用Sephadex-G10凝胶柱除乳糖，得到羊乳寡糖样品；

步骤三、利用Carbo Pac^TMPA20糖分离柱对所述羊乳寡糖样品的乳糖脱除率及低聚糖保留率进行测定；

步骤四、优化液相条件并采用超高效液相Q-Exactive Focus质谱对所述羊乳寡糖样品的成分及结构进行定性及定量分析；

所述步骤一中，羊乳脱脂、脱蛋白的具体方法为：

取羊乳在3～8℃、8000～10000rpm条件下离心15～30min，去除上层的脂肪和底部少量的蛋白质，取出中间层按体积比1:2～1:6的比例加入无水乙醇，温度为-80～4℃下反应2～12h，反应结束后在3～8℃下4000×g离心15～30min，取上清液，干燥，得到所述羊乳寡糖粗品；

所述步骤二中，除乳糖的具体方法包括：

2.1)首先将Sephadex-G10凝胶放置在烧杯中用超纯水浸泡10～15h，真空泵除气泡1～2h后加入层析柱中，然后使用超纯水在流速为2.5～3mL/min下预压12h；

2.2)将所述羊乳寡糖粗品上样到Sephadex-G10凝胶柱中，采用超纯水为洗脱液，流速为2～2.5mL/min，利用自动收集器每2min收集一次过柱液体，所述过柱液体经苯酚-硫酸法检测，置于-80℃冰箱中备用；

所述步骤四中，超高效液相Q-Exactive Focus质谱的液相条件为：

采用ACQUITY UPLC氨基色谱柱，色谱柱规格2.1mm×100mm，柱填料粒径为1.5～2μm，柱温30～40℃，流速0.2～0.5mL/min，流动相A为乙腈，流动相B为10mM甲酸铵，梯度洗脱的条件为：0-20min，95％-78％A；20-35min，78％-73％A；35-38min，73-62％A；38-45min，62％-50％A；45-55min，50％-95％A；55-65min，95％-95％A；液相剩余部分为流动相B；

所述步骤四中，超高效液相Q-Exactive Focus质谱的质谱条件为：电喷雾离子源：正离子模式和负离子模式喷雾电压均为5～20kV，一级离子的质量扫描范围300--2000m/z，柱温为30～40℃。

2.如权利要求1所述的羊乳寡糖测定方法，其特征在于，所述干燥采用真空浓缩仪浓缩干燥。

3.如权利要求1所述的羊乳寡糖测定方法，其特征在于，所述步骤三中，测定乳糖脱除率及低聚糖保留率的具体方法为：

采用超纯水作为流动相A，250mM NaOH作为流动相B，柱温为35℃，以0.4mL/min的流速对所述羊乳寡糖样品进行梯度洗脱，梯度洗脱的条件：0-40.1min，7.2％-100％A；40.2-45min，100％-100％A；45.1-55min，100％-7.2％A；剩余液相部分为流动相B，采用金电极脉冲安培检测器，检测样品中乳糖含量，并收集含有羊乳寡糖的收集管。