[发明专利]羊乳寡糖测定方法

说明书

本发明公开了一种羊乳寡糖测定方法，包括以下步骤：步骤一、对羊乳脱脂、脱蛋白得羊乳寡糖粗品；步骤二、利用Sephadex‑G10凝胶柱除乳糖，得到羊乳寡糖样品；步骤三、利用Carbo Pac^TMPA20糖分离柱对所述样品的乳糖脱除率及低聚糖保留率进行测定；步骤四、优化液相条件并采用超高效液相Q‑Exactive Focus质谱对所述品的成分及结构进行定性及定量分析。本发明首次建立了一种有效分离并测定羊乳寡糖的方法，对分离难度较大的羊乳样品，通过凝胶柱层析，实现了乳糖的有效去除，通过液相条件的优化实现了同分异构体的测定，通过质谱仪器的合理设定鉴定了羊乳中49种低聚糖。

技术领域

本发明涉及一种羊乳寡糖分离及测定方法。

背景技术

乳是一种复杂的营养成分包括脂肪、蛋白质、碳水化合物，其中乳也提供了哺乳动物的营养需要。在碳水化合物中乳糖的含量超过80％，而游离乳寡糖含量占总糖的4％左右，因此乳糖的去除对于乳寡糖的分析产生了重要的作用。

研究证明，乳寡糖可以平衡肠道微生物群以调节免疫系统，唾液酸化的寡糖可以促进脑发育，并且作为半乳糖的来源用于合成半乳糖脑苷脂，唾液酸用于脑灰质中的神经节苷脂以及糖蛋白产生。研究发现，人乳中含有200余种低聚糖，然而，由于大小，电荷和结构的差异性，迄今为止，只有低分子量的人乳低聚糖可以通过化学方法合成。因此，寻找具有类似于人乳低聚糖生物活性的替代来源并应用于婴儿配方食品已引起人们的关注。羊乳是婴幼儿配方粉的重要乳基料之一，有研究表明羊乳中低聚糖含量约为0.25-0.30g/L，是牛乳低聚糖含量的8倍左右，是潜在的母乳低聚糖替代物。但由于检测方法的限制及技术壁垒，我国羊乳中低聚糖结构的研究较为落后，因此建立有效的羊乳低聚糖检测手段对我国羊乳低聚糖研究具有重要意义。

基于这些生理功能，人们开始关注于乳寡糖的研究。国内对于羊乳寡糖结构的研究鲜有报道，且并没有一个羊乳寡糖的检测方法。低聚糖的分离和纯化是低聚糖检测的关键，因其自身组成、连接、衍生化、微观不均一性等方面的高度复杂性，使其监测具有很大困难。在对羊乳中的低聚糖进行分析时，一些高丰度的低聚糖会遮盖低丰度低聚糖的检测信号，阻碍了低聚糖的完全鉴定，这就需要对低聚糖样品进行富集纯化操作，减少杂质的混合，提高检测的灵敏度。由于羊乳中乳糖含量较高，而低聚糖的含量较低，分离低含量成分的难度很大，另一个方面，羊乳中寡糖的单糖个数一般为3-10之间，分子量相近，更是增加了操作难度，同时，同分异构体的保留时间和质谱图又非常相似，给定性带来很大困难。因此选择合适的方法，对羊乳寡糖进行分离并测定，是一项探索性很强的工作。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种羊乳寡糖测定方法，通过凝胶柱层析，实现了对低聚糖测定影响物质乳糖的有效去除，获得羊乳寡糖样品，随后利用高效阴离子交换色谱对乳糖去除率及低聚糖保留率进行定量分析，利用超高效液相Q-Exactive Focus质谱对羊乳低聚糖进行鉴定，通过对液相条件的优化实现了对羊乳寡糖同分异构体的定性及定量分析。采用本发明所述测定方法，最终鉴定出了49种羊乳寡糖并实现了对该49种羊乳寡糖结构组成的分析，分离效果好，且样品无需衍生化，保留了寡糖的原始结构，另外操作过程简单，结果稳定，重复性好。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种羊乳寡糖测定方法，包括以下步骤：

步骤一、对羊乳脱脂、脱蛋白，提取羊乳寡糖粗品；

步骤二、对所述羊乳寡糖粗品利用Sephadex-G10凝胶柱除乳糖，得到羊乳寡糖样品；

步骤三、利用Carbo Pac^TMPA20糖分离柱对所述羊乳寡糖样品的乳糖脱除率及低聚糖保留率进行测定；

步骤四、优化液相条件并采用超高效液相Q-Exactive Focus质谱对所述羊乳寡糖样品的成分及结构进行定性及定量分析。