[发明专利]一种基于蛋白质组学鉴别古代毛织品残片毛种类的方法

权利要求书

1.一种基于蛋白质组学鉴别古代毛织品残片毛种类的方法，其特征在于，以g和mL计，包括如下步骤：

1）称取等量已混淆的古代山羊毛、绵羊毛、骆驼毛织品，用去离子水反复清洗，去除表面污渍， 30-35℃真空烘干，分别记为A、B、C三组；

2）将步骤1）烘干的A、B、C三组样品，分别浸没在pH =1.5-2.5的草酸溶液中，静置1-2h，用去离子水搓洗至中性，30-35℃真空烘干；

3）将步骤2）烘干的A、B、C三组样品，以1：15-25的浴比加入含有0.05-0.15mol/L LiBr和0.02-0.04mol/L 十二烷基硫酸钠的溶液中浸没，调节pH值到8-11，40-50℃下以190-210W的功率超声30-50min后，放入微波反应器辐射水解6-8min；

4）从反应器中取出，倒入三口烧瓶，将三口烧瓶放在恒温水浴锅中，调节水浴温度70-90℃，通氮气10-20分钟，排除氧气，缓缓加入10-25ml的2.5-3.5 mol/L 三(2-羧乙基)膦溶液，通氮气搅拌，使毛溶解，真空抽滤，去除未溶毛及杂质；

5）在4-8℃下，加入无水甲醇，反复浸泡，使蛋白析出，滤出蛋白后，加入去离子水溶解，在2-6℃条件下用透析袋透析，前9-12h，每隔1-2h换一次水，第12- 24h每隔2-5h换一次水，第24-48h每隔5-10h换一次水，第48-72h，每隔10-15h换一次水，除去表面活性剂、金属盐杂质；低温真空浓缩至原体积的1/4-1/2，得到角蛋白提取液A、B、C；

6）向15-30 m L正己烷中加入摩尔比为18-22:1的水和十二烷基苯磺酸钠，制得油相溶液；

7）向步骤6）所得油相溶液中，加入质量分数为45-55%的生物质焦油水溶液，再加入摩尔比为1.8-2.2:1的正戊醇和十二烷基苯磺酸钠，用力摇晃，溶液变淡黄色，即得到反相微乳液，于室温静置10-13h；

8）向步骤7）所得反相微乳液中加入0.2-0.4 g十二胺，室温下超声8-12 min；然后向含聚四氟乙烯内胆的反应釜内倒入超声后的混合溶液，在110-130℃马弗炉中放置2-4 h，取出，自然冷却至室温；用无水丙醇破乳，洗涤数次，离心，制得碳量子点原始溶液；

9）用柠檬酸将0.02-0.04 mol/L的柠檬酸钠溶液的pH调为2.5-2.8，将此溶液与350-450μl步骤8）所得碳量子点原始溶液混合均匀，制得碳量子点染胶溶液；

10)组装制胶器，灌注分离胶，加入纯化水，待分离胶的胶面与水形成可见的界面时，轻轻倒出纯化水，擦干纯化水后插上梳子，注入浓缩胶；待浓缩胶完全聚合后，将梳子轻轻拔出；

11)取角蛋白提取液A、B、C于2×样品缓冲液按1∶0.8-1.2比例混合，水浴加热于93-97℃下加热1.5-2.5 min，使蛋白质变性并确保结合最大量的十二烷基硫酸钠；样品冷却至室温后，分别取10-20μl角蛋白提取液A、B、C加入凝胶点样孔，进行SDS-PAGE凝胶电泳；

12)电泳完毕后，切断电源，取出凝胶， 浸入步骤9）所得碳量子点染胶溶液，以低速在摇床上振荡2.5-3.5h，放到凝胶成像仪中，观察样品的电泳图像；

13)将经步骤12)所得的染色样品的蛋白质条带割下来装入1.0-2.0ml离心管中，加入300-400ul去离子水振荡洗涤，吸出液体，重复一次，加入含10-30％甲醇、4-8%甘油、8-12％乙酸的脱色液40-70ul，静置2-4min，用去离子水终止反应并重复洗涤一次，吸出多余的液体；加入180-220ul 35-45mmol/L碳酸氢铵溶液振荡洗涤2-4min，重复一次；加入110-160ul乙腈振荡，待胶块变白，吸弃乙腈，置于真空浓缩仪中干燥8-12min；

14)向步骤13)所得的离心管中加入50-80ul的胰蛋白酶溶液，完全盖住胶粒冰浴40-50min，使胶粒吸收酶解液溶胀，然后在35-40℃烘箱中孵育13-15h进行酶解；

15)采用HPLC-MS/MS对样品A、B、C进行质谱分析，根据质谱检测得到的氨基酸序列与三种毛的氨基酸序列数据库对比，若样品符合山羊毛氨基酸序列，为山羊毛织品；若样品符合绵羊毛氨基酸序列，则为绵羊毛织品；若样品符合骆驼毛氨基酸序列，则为骆驼毛织品。