[发明专利]一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法

说明书

本发明涉及羊毛检测技术领域，公开了一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法。本发明先采用中性洗毛的工艺去除羊毛的油脂、杂质，将羊毛分成12等份，然后采用排列组合的方法用不同蛋白酶对羊毛由外向内逐层酶解，对于仅用过酸性蛋白酶酶解的羊毛用三(2‑羧乙基)膦特异地断裂二硫键，先对未断二硫键的各组羊毛进行氨基酸分析，得到氨基酸的径向分布，再对比断裂二硫键前后的组别，得到羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布。本发明根据羊毛角蛋白中氨基酸分布具有不同层次的特点，采用排列组合的多次酶解法对角蛋白进行溶解，对氨基酸的破坏小，准确性高，特异性强，方法较为环保。

技术领域

本发明涉及羊毛检测技术领域，尤其涉及一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法。

背景技术

羊毛是细长的实心圆柱体，呈卷曲状，纤维的组织结构分三层，即鳞片层、皮质层和髓质层。皮质层是羊毛纤维的主要组成部分，由许多角蛋白组成。皮质层分为正皮质层和副皮质层两种。在卷曲波外侧的称为正皮质细胞，内侧的称为副皮质细胞。

溶解羊毛提取角蛋白是解决资源短缺和资源浪费的重要手段。但是羊毛角蛋白的结构十分复杂，主要以a-螺旋、β-折叠形式存在，其中a-螺旋结构占角蛋白一半以上。

角蛋白具有很复杂的空间网状结构。其中a-螺旋角蛋白主要依托盐式键、氢键、二硫键等键能横向交联构成较稳定的空间螺旋结构。羊毛角蛋白大分子是由十八种氨基酸通过肽键连接构成多肽长链，同时在这些长链中，又含有氢键、二硫键、盐式键等多种键能使角蛋白具有稳定的空间结构。而其中，对羊毛角蛋白结构稳定做出最大贡献的是二硫键，所以，我们溶解羊毛的重要一点就是要打破二硫键。这些复杂的化学结构为人们羊毛角蛋白的提取增加了无尽的困难，因此，解析羊毛角蛋白中氨基酸的分布，特别是二硫键稳定的键合折叠的氨基酸分布，就显得尤为重要。

但是目前关于羊毛角蛋白中氨基酸分布的分析较少，仅有学者通过使用酸、碱溶液或各种蛋白酶对羊毛角蛋白进行不同程度（通过控制水解/酶解时间的长短来实现径向上的逐层侵蚀）的溶解，以得到残余的角蛋白纤维，再采用红外光谱、X射线衍射等技术分析角蛋白中氨基酸径向分布。但上述溶解方法容易损伤氨基酸，并且容易对角蛋白内层暂时不希望被水解的蛋白质造成误水解/酶解，从而造成分析结果不够准确。此外，上述方法还无法进行较详细的定量研究，难以应用到羊毛角蛋白的氨基酸分析中。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法。本发明根据羊毛角蛋白纤维径向上氨基酸分布的特点，通过排列组合的多次酶解法对角蛋白进行溶解，利用针对性极强的还原剂断裂二硫键，易于分析，特异性强，结果准确，条件温和，对氨基酸的破坏小。

本发明的具体技术方案为：一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，包括以下步骤：

1）称取羊毛作为样品，用去离子水反复搓洗，去除表面杂质，烘干。

2）将烘干的样品在50-60℃下，以1:95-105的浴比在含有0.06-0.08wt%十二烷醇聚氧乙烯醚和0.2-0.4w%硫酸钠的混合溶液中煮25-35min，洗除油脂、杂质，重复一次。

本发明洗除油脂的过程，采用中性洗毛的工艺，减小了对羊毛角蛋白的损伤，同时避免了碱性条件下，二硫键的易位。

3）洗除油脂之后，将样品用去离子水冲洗干净，放入40-50℃烘箱，得到干燥的羊毛。

4）将步骤3）烘干的羊毛分成A1、A2、B1、B2、C1、C2、D、E、F1、F2、G、H等质量份的12组，其中A1组作为对照组，不做任何处理；将A2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:18-20的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min。