[发明专利]一种液滴数字PCR芯片及其使用方法

说明书

本发明设计了一种液滴数字PCR芯片，集成了液滴形成、扩增与检测三个功能单元。其中，芯片液滴形成单元包含油孔、PCR试剂孔及相应管道，油孔管道与PCR试剂孔管道形成十字交叉；芯片扩增单元为蛇形管道；芯片检测单元包括动态检测位和静态检测位，所述动态检测位为管道，与光学检测模块配套，实时检测完成扩增的液滴；所述静态检测位收集所有扩增后的液滴，利用CCD相机同时检测阳性扩增。

技术领域

本发明涉及数字PCR技术领域，尤其涉及一种集液滴形成、扩增与检测一体化的微流控芯片。

背景技术

PCR 技术作为一种核酸体外扩增技术，具有特异性强，灵敏度高，快速简便，重复性好，所需模板量少等优点，已广泛应用于法医检测，临床诊断，分子生物学研究等领域。PCR的基本原理是模仿DNA的天然复制过程，依赖寡核苷酸引物和模板的特异性互补，经过多次变性-退火-延伸的温度循环过程，实现目标片段的指数级扩增。

数字PCR技术是一种新的核酸检测和定量技术，与传统定量PCR技术不同，数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数。由于这种检测方式具有比传统qPCR更加出色的灵敏度、特异性和精确性而得到广泛应用。这项技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面表现出的优势已被普遍认可，而其在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、NGS测序文库精确定量和结果验证等诸多方面具有的广阔应用前景已经受到越来越多的关注。

数字PCR采用的策略非常简单，就是分而治之，将一个标准PCR反应体系平均分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”。常见的分液方法包括液滴法和网格法。液滴法是利用油和表面活性剂包裹PCR试剂形成大小均一的液滴，而网格法是在芯片上制造微小的孔道实现分液。扩增结束后，通过“发光”反应器的数目计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。

微流控芯片技术是在微尺度空间下利用高度集成的功能单元实现多步骤的生化反应过程，减少人工操作，实现样品入-结果出（Sample in- Answer out），为生物医学诊断、分析化学、生命科学等领域提供自动化解决方案。微流控芯片的优势在于减小反应体系和所需试剂用量，自动化控制减少人工操作过程，提高操作的一致性。目前，市场上的主流数字PCR产品包括Bio-Rad公司的QX100和QX200；RainDance公司的RainDrop；Fluidigm公司的Bio-Mark HD系统和Thermo Fisher Scientific公司的QuantStudio系统。上述产品通常包含2个以上设备——分液（及扩增）设备和结果读取设备。增加了人工操作步骤且带来扩增产物暴露的风险。为了解决该问题，本发明设计了一种一体化芯片，集成液滴形成、扩增与检测功能。

发明内容

本发明设计了一种液滴数字PCR芯片，集成了液滴形成、扩增与检测三个功能单元。芯片设计简单化，不需要复杂结构和微阀，降低加工难度易于生产。同时，还提供所述液滴数字PCR芯片的使用方法。

本发明第一个方面提供一种液滴数字PCR芯片。