[发明专利]一种检测分析幽门螺旋杆菌的毒性及致病性的方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断或治疗目的的检测分析幽门螺旋杆菌的毒性及致病性的方法，其特征在于，对幽门螺旋杆菌目标菌株进行DNA提取和采用二代测序方法进行全基因组序列检测，根据全基因组序列检测的结果进行全基因组测序数据数据分析和致病相关基因特异性分析；分析方法包括以下步骤：

1)对所述致病相关基因进行分型分类；所述致病相关基因分为重要分型基因和其他致病相关基因； 所述重要分型基因包括毒性相关基因A、空泡细胞毒素A基因、膜外炎症蛋白A基因和粘 附相关脂蛋白AB基因；其中，毒性相关基因A分为CagA西方型和CagA东方型，空泡细胞毒素A 基因分为s1/m1型、s1/m2型、s2/m1型、s2/m2型，膜外炎症蛋白A基因分为ON型和OFF型，粘附相关脂蛋白AB基因分为AlpAB东方型和AlpAB西方型；所述其他致病相关基因包括IV型分泌系统基因、其他毒性基因致病岛上的基因、空泡 蛋白VacB基因、膜外蛋白家族基因、尿素酶家族基因、鞭毛蛋白家族基因、胶原蛋白酶基因、 十二指肠溃疡诱导基因、表皮接触诱导基因和ADP-庚糖合成酶基因；

2)根据全基因组序列检测的结果统计致病相关基因的reads数；

3)将重要分型基因分别统计比对到各自参考序列的百分比；其中，毒性相关基因A分别统计比对到参考序列cagA阳性西方型、cagA阳性东方型和cagA阴性的reads的百分比；空泡细胞毒素A基因分别统计比对到参考序列s1/m1、s1/m2、s2/m1、s2/m2的reads的百分比；膜外炎症蛋白A基因分别统计比对到参考序列ON型、OFF型的reads的百分比；粘附相关脂蛋白AB基因分别统计比对到参考序列AlpAB西方型、AlpAB东方型的reads的百分比；

4)对重要分型基因进行分型判定，对其他致病相关基因进行功能完整度判定，判定依据如下：

a .“+”表示阳性，“-”表示阴性，即不存在；

b .CagA的毒性：东方型西方型–；VacA的毒性：s1/m1s1/m2s2/m1s2/m2(-)；OipA的诱导炎症功能：ONOFF；AlpAB的诱导炎症功能：AlpAB东方型＞AlpAB西方型；东方型或S1/ M1或ON占比≥60％时功能判定为毒性强或诱导炎症，东方型或S1/M1或ON占比介于10％～ 60％之间时功能判定为毒性中等或部分诱导炎症，东方型或S1/M1或ON占比≤10％时功能 判定为毒性弱或不诱导炎症；

c .其他致病相关基因中Reads数≥10的基因的判定为“+”，Reads数＜10的基因的判定为“-”；

5)根据上述判定结果，对重要分型基因判断其毒性及功能意义解读，对其他致病相关基因判断其功能完整性及功能意义解读；

所述对其他致病相关基因判断其功能完整性及功能意义解读的方法如下：对于IV型分泌系统基因，若IV型分泌系统基因的判定结果均为 “+”，则IV型分泌系统功能完整，幽门螺旋杆菌向宿主细胞注射毒性蛋白A的功能正常；若IV型分泌系统基因的判定结果出现“-”且出现在关键组分基因中，则IV型分泌系统功能不完整，幽门螺旋杆菌向宿主细胞注射毒性蛋白A的功能受影响； 对于其他毒性基因致病岛上的基因，若其他毒性基因致病岛上的基因的判定结果均为 “+”，则辅助或保护CagA蛋白注射入宿主细胞的功能正常；若其他毒性基因致病岛大部分基因缺失，判定结果出现“-”且出现在关键组分基因中，则辅助或保护CagA蛋白注射入宿主细胞的功能受损；

对于空泡蛋白VacB基因，若判定结果均为“+”，则辅助性毒性蛋白功能正常；若判定结果为“-”，辅助性毒性蛋白功能受损，且会导致cagA基因和flaB基因上调；

对于膜外蛋白家族基因，若膜外蛋白家族基因的判定结果均为“+”，则膜外蛋白功能正常，宿主免疫逃避幽门螺旋杆菌粘附宿主细胞的功能正常；若判定结果出现“-”，则膜外蛋白功能受影响；

对于尿素酶家族基因，若尿素酶家族基因的判定结果均为“+”，则幽门螺旋杆菌中和酸度功能正常；若判定结果出现“-”，则幽门螺旋杆菌中和酸度功能受影响；

对于鞭毛蛋白基因，若鞭毛蛋白基因的判定结果均为“+”，则幽门螺旋杆菌定向移动功能正常；若判定结果出现“-”，则幽门螺旋杆菌定向移动功能受影响；

对于胶原蛋白酶基因，若判定结果为“+”，则幽门螺旋杆菌的穿透功能正常；若判定结果为“-”，则幽门螺旋杆菌穿透功能受损；

对于表皮接触诱导基因，若判定结果为“+”，则幽门螺旋杆菌接触消化道表皮能力正常；若判定结果为“-”，则幽门螺旋杆菌接触消化道表皮能力受损；

对于十二指肠溃疡诱导基因，若判定结果为“+”，则幽门螺旋杆菌诱导十二指肠溃疡能力正常；若判定结果为“-”，则幽门螺旋杆菌诱导十二指肠溃疡能力受损；

对于ADP-庚糖合成酶基因，若判定结果为“+”，则幽门螺旋杆菌诱导激活NF-kB转录因子能力正常；若判定结果为“-”，则幽门螺旋杆菌诱导激活NF-kB转录因子能力受损；

所述 I V型分泌系统基因由以下基因组成： HP0522_cag3、HP0523_cag4、HP0524_cag5、HP0526_cag6、HP0527_cag7、HP0528_cag8、 HP0530_cag10、HP0531_cag11、HP0532_cag12、HP0537_cag16、HP0539_cag18、HP0540_ cag19、HP0541_cag20、HP0542_cag21、HP0543_cag22、HP0544_cag23、HP0546_cag25、HP0525、 HP0529_cag9；其中，I V型分泌系统基因的关键组分基因为：HP0522_cag3、HP0523_cag4、HP0524_cag5、HP0526_cag6、HP0527_cag7、HP0528_cag8、 HP0530_cag10、HP0531_cag11、HP0532_cag12、HP0537_cag16、HP0539_cag18、HP0540_ cag19、HP0541_cag20、HP0542_cag21、HP0543_cag22、HP0544_cag23、HP0546_cag25；

所述其他毒性基因致病岛上的基因由以下基因组成：HP0545_cag24、HP0520_cag1、HP0534_cag13、 HP0535_cag14、HP0536_cag15、HP0538_cag17、HP0521_cag2、HP0441_VirB4homologue、 HP0017_virB4homologue、HP0459_virB4homologue；其中，其他毒性基因致病岛上的关键组分基因为HP0545_cag24；

所述空泡蛋白VacB基因是基因HP1248_vacB；

所述膜外蛋白基因由以下基因组成：HP1564_ABC_transporter_substrate-binding_protein、HP0009_omp1、HP0324_omp10、HP0472_omp11、HP0477_omp12、HP0671_omp14、HP0706_omp15、HP0722_omp16、HP1125_omp18、HP0896_omp19、HP0923_omp22、HP1107_omp23、HP1113_omp24、HP1156_omp25、HP1157_omp26、HP1177_omp27、HP1342_omp29、P0079_omp3、HP1395_omp30、HP1469_omp31、HP1501_omp32、HP0127_omp4、HP0227_omp5、HP0229_omp6、HP0252_omp7、HP0317_omp9、HP0839_ompP1_P1、HP0725_ omp17、HP1243_omp28；

所述尿素酶家族基因由以下基因组成：HP0070_ureE、HP0069_ureF、HP0068_ureG、HP0067_ ureH、HP0071_ureI、HP0072_ureB；

所检测的鞭毛蛋白基因由以下基因组成：HP0601_flaA、HP0115_flaB、HP0840_flaA1、HP1557_fliE、HP1559_flgB、HP1558_flgC、HP1041_flhA、HP1035_flhF、HP0770_flhB、HP1419_fliQ、HP0173_fliR、HP1420_fliI、HP0870_flgE、HP0908_flgE、HP1119_hap1 ,flgK、 HP0752_fliD、HP0815_motA、HP0816_motB、HP0352_fliG、HP1031_fliM、HP0753_fliS、 HP0327_flaG、HP0797_HpaA、HP0584_fliN、HP0295_fla、HP1575_flhB、HP1030_fliY、HP0907_flgD、HP1274_pflA、HP0751_flaG、HP0410_hpaA、HP1192、HP1462、HP0232、HP0325_flgH、HP0351_fliF、HP0246_flgI、HP1092_flgG、HP1585_flgG、HP0353_fliH；

所述胶原蛋白酶基因是基因HP0169_prtC；所述表皮接触诱导基因是基因dupA；所述十二指肠溃疡诱导基因是基因iceA；所述ADP-庚糖合成酶基因是rfaE；

对IV型分泌系统基因的功能解读为，HP0522_ cag3、HP0524_cag5、HP0526_cag6、HP0530_cag10、HP0531_cag11、HP0532_cag12、HP0537_ cag16、HP0539_cag18、HP0540_cag19、HP0541_cag20、HP0542_cag21、HP0543_cag22、 HP0544_cag23是CagA蛋白转移所必需的；HP0523_cag4缺失会影响CagA转移；HP0528_cag8 失活会消除幽门螺旋杆菌将CagA蛋白转移到胃细胞中的能力；HP0546_cag25缺失会导致细 菌缺失CagA蛋白的转运能力；

对其他毒性基因致病岛上的基因的功能解读为，HP0545_cag24是CagA蛋白转移所必需的，并能刺激胃上皮细胞产生和分泌白细胞介素-8；

对空泡蛋白VacB基因的解读为，HP1248_vacB基因缺失，会导致其他基因上调，该基因和细菌适应温度和pH值条件有关； 对膜外蛋白家族基因的功能解读为，HP1564_ABC_transporter_substrate-binding_ protein、HP0324_omp10、HP0472_omp11、HP0477_omp12、HP0671_omp14、HP0706_omp15、 HP0923_omp22、HP1107_omp23、HP1113_omp24、HP1156_omp25、HP1157_omp26、HP1342_ omp29、P0079_omp3、HP1395_omp30、HP1469_omp31、HP1501_omp32、HP0227_omp5、HP0229_ omp6、HP0252_omp7、HP0317_omp9、HP0839_ompP1_P1翻译的蛋白是外膜蛋白组成成分； HP0009_omp1参与幽门螺旋杆菌粘附到胃上皮细胞过程；HP0722_omp16与幽门螺旋杆菌的 粘附相关；HP0725_omp17的缺失会减少宿主中性细胞的激活；HP0796_omp18、HP1125_omp18 的蛋白在幽门螺旋杆菌感染宿主过程中引起的IFN-γ的调节中起到重要作用；HP0896_ omp19的蛋白能在凝集素介导的作用下帮助幽门螺旋杆菌粘附到胃黏膜上；HP1177_omp27 的蛋白与CEACAM1结合物帮助毒性因子CagA进入宿主细胞，增强白细胞介素-8的释放； HP0127_omp4的蛋白协助幽门螺旋杆菌粘附胃表皮；

对尿素酶家族基因的功能解读为，HP0070_ureE缺失会导致其转移镍元素能力下降并且使得脲酶活性显著下降；HP0069_ureF、HP0068_ureG、HP0067_ureH是将镍元素转移到脲酶活性位点的蛋白之一；HP0071_ureI是幽门螺旋杆菌在胃部生存必要蛋白；HP0072_ureB是幽门螺旋杆菌保守蛋白之一，可以被作为抗体；

对鞭毛蛋白基因的功能解读为，HP0601_flaA、HP0115_flaB对幽门螺旋杆菌运动性起到重要的作用；HP0840_flaA1缺失会造成幽门螺旋杆菌的生长减慢；HP1557_fliE、HP1559_flgB、HP1558_flgC缺失均会造成幽门螺旋杆菌菌株没有鞭毛也没有运动性；HP1041_flhA、HP0770_flhB、HP1419_fliQ、HP0173_fliR与转移主要的鞭毛蛋白到鞭毛结构的尾部有关；HP1035_flhF与调节鞭毛的合成、及鞭毛运动性相关；HP1420_fliI与驱动III型鞭毛外排有关；HP0870_flgE、HP0908_flgE和鞭毛的驱动力紧密相关；HP1119_hap1 ,flgK与鞭毛组装的 过程中控制鞭毛的长度有关；HP0752_fliD与鞭毛组装过程中扮演鞭毛保护蛋白的角色有 关；HP0815_motA、HP0816_motB与转动、修复鞭毛有关；HP0352_fliG、HP1031_fliM、HP0584_ fliN、HP1030_fliY与转移蛋白、调节鞭毛驱动引擎的转动和转化有关；HP0753_fliS与防止 鞭毛蛋白过早聚集并且参与鞭毛组装有关；HP0327_flaG、HP0751_flaG与极性鞭毛蛋白有 关；HP0797_HpaA、HP0410_hpaA与在低pH值的条件下防止鞭毛蛋白亚基的降解有关； HP0295_fla与鞭毛钩连接蛋白有关；HP1575_flhB与外排蛋白的成分有关；HP0907_flgD与 鞭毛钩蛋白的capping蛋白有关；HP1274_pflA与瘫痪的鞭毛表型有关；HP1192、HP1462、 HP0232与参与鞭毛运动的蛋白有关；

所述胶原蛋白酶基因的功能解读为，HP0169_prtC会降低幽门螺旋杆菌对胃细胞生存和增殖的影响；所述表皮接触诱导基因的功能解读中，dupA和胃溃疡有密切的关系；所述十二指肠溃疡诱导基因的功能解读中，iceA与消化性溃疡疾病密切相关；所述ADP-庚糖合成酶基因的功能解读中，rfaE缺少会导致幽门螺旋杆菌不能激活NF-kB转录因子 ,并且使得肠胃上皮细胞分泌的IL-8减少。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)包括：用fastqc软件对测序下机的序列fastq的质量画图，然后用trimmomatic软件去除测序接头低质量碱基，保证序列的平均质量大于或等于Q30；用bowtie2软件，将fastq文件比对到参考基因的序列上，生成bam文件；用picard软件对bam文件排序，然后去除重复序列；用samtools软件对经排序和去除重复序列后的bam文件进行比对结果的统计、测序位点深度的统计、以及各个致病相关基因对应的reads数的统计。