[发明专利]一种利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法

权利要求书

1.一种利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）总脂的提取：取冻干藻粉与95%乙醇混合后，持续超声处理2～3 h；然后，藻粉混合液于50 ℃～60 ℃恒温水浴条件下磁力搅拌提取总脂；

（2）棕榈油酸的浓缩：将步骤（1）获得的总脂先后经过皂化、低温冷冻沉淀、酸解和尿素包埋过程处理，即获得高浓度的棕榈油酸；

所述的真眼点藻纲微藻为类波氏真眼点藻（E. cf. polyphem）；

所述的类波氏真眼点藻的具体培养过程如下：

类波氏真眼点藻的培养温度为24～26 ℃，光照强度为30～320 μmol photons m^-2 s^-1，培养基为mBG-11液体培养基：0.08 g/L NaNO₃，0.04 g/L K₂HPO₄，0.075 g/L MgSO₄·7H₂O，0.036 g/L CaCl₂·2H₂O，0.006 g/L柠檬酸，0.006 g/L FeCl₃·6H₂O，0.001 g/L EDTA，0.02 g/L Na₂CO₃，2.860 g/L H₃BO₃，1.810 g/L MnCl₂·4H₂O，0.391 g/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.079 g/L CuSO₄·5H₂O，0.220 g/L ZnSO₄·7H₂O，1L去离子水，121 ℃、20 min 高温灭菌处理；

1）由藻种室获得藻种后，转接于mBG-11液体培养基中，静置培养4～5天，光照为30～40μmol photons m^-2.s^-1；然后，将该藻种继续转接至mBG-11液体培养基中静置培养5～7天，待藻液的OD₇₅₀达到1.5后，进行下一步扩种；

2）将步骤1）中的藻株接入光柱状玻璃生物反应器中，培养基为mBG-11液体培养基，光强70～100 μmol photons m^-2 s^-1，通入含有1% CO₂的压缩空气，鼓气培养5～7天；

3）将步骤2）获得的藻种通过无菌水离心洗涤后，按照OD₇₅₀ = 0.60 ± 0.02的初始接种密度转接至上述光柱状玻璃生物反应器中，培养基为mBG-11液体培养基，其中的氮源为硝酸钠，设置1 mM的初始氮浓度，光强为300～320 μmol photons m^-2.s^-1，通入含有1% CO₂的压缩空气；

4）鼓气培养后，通过静置沉淀过夜收集藻体，然后真空冷冻干干燥获得冻干藻粉；

步骤（2）中所述的棕榈油酸的浓缩的具体步骤如下：

称取一定量的总脂与10% KOH-乙醇液体混合，置于70～80 ℃恒温水浴中磁力搅拌皂化1.0～1.5 h；待皂化液冷却至室温后，放入-20 ℃中静置24～36 h；低温冷冻处理后，分离混合液中的固体相和液体相，收集液体相；上述的液体相加入正己烷反复提取，分相并收集液体相层，然后缓慢加入浓盐酸使得溶液pH=1～2，不饱和的脂肪酸盐酸解生成游离脂肪酸；通过去离子水反复洗涤后，40 ℃～50℃真空旋转蒸发获得游离不饱和脂肪酸；称取一定质量的游离不饱和脂肪酸和尿素、95%乙醇混合后，置于50 ℃恒温水浴中搅拌直至溶液变得澄清，随后放入4 ℃中尿素包埋36～48 h；尿素包埋结束后，同样抽滤得到获得尿素结晶，50 ℃热水溶解后，并用正己烷萃取；正己烷相经去离子水洗涤后40 ℃～50℃真空旋转蒸发，即得到高浓度的棕榈油酸。

2.根据权利要求1所述的利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法，其特征在于：

所述的冻干藻粉与95%乙醇混合为按照m/v=1:30～1:40的比例进行混合。