[发明专利]用于检测皮炎芽生菌的引物探针组及其应用

权利要求书

1.一种检测皮炎芽生菌的Real-time PCR特异性引物和探针，其特征在于，包括设计的引物F、引物R和探针P，所述的引物F、引物R和探针P分别是按下述碱基序列由DNA合成仪合成DNA片段，具体为：

引物F：5'- ATTCAAGACAACAGAGCC -3'；

引物R：5'- GCAACTTGGATAATGCGT -3'；

探针P：5'-FAM- CAGGCGAAATCGAGAATCGG -BHQ1-3'。

2.一种采用权利要求1所述的特异性引物和探针的皮炎芽生菌的Real-time PCR检测方法，其特征在于以下实验步骤：

（1）被检样本核酸提取：样本处理采用血液基因组DNA提取试剂盒(0.1-1ml)（天根生化科技有限公司，货号DP318）、细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，货号DP302）；

（2）以权利要求1中的特异性引物和探针进行Real-time PCR反应操作：12.5μL 2×Reaction Buffer、0.2μL Taq DNA聚合酶溶液（含0.6U Taq DNA聚合酶）、0.15μL dNTP溶液（dNTP溶液中含有dATP、dCTP和dGTP，dATP、dCTP和dGTP在dNTP溶液中的浓度均为33mmol/L）、0.1μL dUTP溶液（dUTP溶液中，dUTP的浓度为100mmol/L）、0.1μL UDG酶溶液（含0.12UUDG酶）、0.5μL引物F溶液、0.5μL引物R溶液、0.5μL探针P溶液、3μL步骤一得到的模板样本，加入ddH₂O至25μL；

反应体系中，引物F的浓度为10μM，引物R的浓度为10μM，探针P的浓度为10μM；

混匀后稍离心在荧光定量PCR仪上进行Real-time PCR反应操作；

（3）pUC57-BAD1质粒Real-time PCR标准曲线制作：测定质粒D_260nm值和D_280nm，用D_260nm/D_280nm值为1.8～2.0的质粒用于制作标准曲线；

（4）检测犬全血样本中的皮炎芽生菌：运行本发明中的反应参数和反应体系，检测样本中含有皮炎芽生菌的BAD1基因，通过计算机分析软件得到Real-timePCR扩增曲线，与阳性对照的扩增曲线比对，判断是否存在皮炎芽生菌。

3.根据权利要求2所述的皮炎芽生菌的Real-time PCR检测方法，其特征在于，所述的反应参数为：50℃，2mins；预变性处理为95℃，10mins；变性处理，95℃，15s，退火/延伸/收集荧光信号处理，50℃，20s，72℃ 20s；反应操作40个循环。