[发明专利]小麦HsfA2亚族基因在拟南芥中耐热性的鉴定方法

权利要求书

1.一种小麦HsfA2亚族基因在拟南芥中耐热性的鉴定方法，其特征在于，其包括如下步骤：

（A）利用重组的方法将小麦HsfA2亚族基因构建到双元表达载体pCAMBIA1300上；

（B）制备农杆菌GV3101感受态细胞，将步骤（A）得到的双元表达载体pCAMBIA1300转化到农杆菌GV3101上；

（C）将步骤（B）得到的转化后的农杆菌GV3101分别侵染拟南芥野生型和步骤（A）所述小麦HsfA2亚族基因的缺失突变体植株，培养至所述拟南芥植株成熟后，收获种子；

（D）筛选经步骤（C）转基因后的拟南芥后代阳性纯合体植株；得到拟南芥过表达阳性纯合体植株以及转拟南芥缺失突变体阳性纯合体植株；

（E）对拟南芥过表达阳性纯合体植株进行基础耐热性和获得耐热性鉴定；

（F）对转基因拟南芥缺失突变体阳性纯合体植株进行恢复耐热性鉴定。

2.根据权利要求1所述的小麦HsfA2亚族基因在拟南芥中耐热性的鉴定方法，其特征在于，所述步骤（A）包括如下步骤：

（1）以酶切连接的方法将35S启动子插入到pCAMBIA1300多克隆位点处的限制性酶切位点Hind III和Xba I之间；

（2）以酶切连接的方法将NOS终止子插入到pCAMBIA1300多克隆位点处的限制性酶切位点Sac I和EcoR I之间；

（3）利用重组反应系统设计扩增所述小麦HsfA2亚族基因的特异引物，利用限制性内切酶Xba I和Sac I对改造载体进行酶切，将PCR产物与线性化载体按1:2的摩尔比混合，利用克隆技术进行重组反应，将所述小麦HsfA2亚族基因插入到35S启动子和NOS终止子之间。

3.根据权利要求1所述的小麦HsfA2亚族基因在拟南芥中耐热性的鉴定方法，其特征在于，所述步骤（B）包括如下步骤：

（a）从LB平板上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含25 mg/L利福平的LB液体培养基中，200 rpm，28℃培养过夜；

（b）取2 mL过夜培养液接种于50 mL含相同抗生素的LB液体培养基中在相同条件下培养至OD₆₀₀=0.5；

（c）菌液冰浴30min，4℃，5000 rpm离心10 min，收集菌体；

（d）将菌体重悬于冰浴的10 mL 0.15M的NaCl中，离心收集菌体；

（e）再悬浮于l mL 20 mmol/L预冷的CaCl₂溶液中，以200 µL/管将菌液分装在1mLEppendorf管中，置液氮中速冻1 min，-70℃保存备用；

（f）在室温下融化农杆菌感受态细胞，加入1 µg表达载体质粒DNA，混匀后冰浴30 min；

（g）置液氮速冻3 min，迅速移至37℃保温3 min；

（h）加入无抗生素的LB 800 µL，28℃震荡培养4 h；

（i）5000 rpm离心30 s收集菌体，涂于含有25 mg/L利福平和25 mg/L潮霉素B的LB平板上，28℃倒置暗培养2-3天；PCR检测阳性菌株。