[发明专利]一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种高效疏水相互作用色谱介质的应用，其特征在于：所述应用为将所述高效疏水相互作用色谱介质应用于高效液相色谱中来分离制备天然蛋白；

所述分离制备天然蛋白具体如下：

（1）将含有天然蛋白的样品进行预处理；

（2）将所述高效疏水相互作用色谱介质装填在高效液相色谱仪的色谱柱中，将步骤（1）处理得到的样品直接进样100μL，进入色谱柱，用流动相A冲洗色谱柱至基线平稳，然后采用流动相B线性从0-100%线性梯度洗脱20-30min，在达到100%时延长洗脱5-10min，流动相A和流动相B的流速均为1.0-2.0 mL/min，检测波长为280nm，收集色谱馏分，经过SDS-15%PAGE分析，即得到天然蛋白；

所述流动相A为2.0~3.0 mol/L (NH₄)₂SO₄和10.0 ~50.0 mmol/L KH₂PO₄的混合液，且pH为7.5；所述流动相B为10.0 ~50.0 mmol/L KH₂PO₄，且pH为7.5；

其中，所述高效疏水相互作用色谱介质的结构式如下：

；

所述高效疏水相互作用色谱介质是通过以下方法制备得到的：

（1）硅胶活化；

（2）制备环氧化硅胶：按照1g：50mL将步骤（1）得到的活化硅胶加入无水甲苯中，超声处理3-5min，然后在搅拌条件下向其中缓慢加入硅烷偶联剂，所述活化硅胶和硅烷偶联剂的质量体积比为1g:1mL~1g:2 mL，升温至90-120 ℃，回流并搅拌9-12h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，真空干燥，即得到环氧化 硅胶；

（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质：按照体积比1:200，将苄胺加入干燥的1，4-二氧六环溶液中，超声处理3-5min，向其中加入环氧化 硅胶，所述环氧化硅胶和卞胺的质量比为1:2~1:4，超声处理3-5min，然后在80 ℃下回流并搅拌7h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，真空干燥，即可。

2.根据权利要求1所述高效疏水相互作用色谱介质的应用，其特征在于：步骤（1）所述硅胶活化的步骤具体如下：按照质量体积比1g:10mL ~1g:20mL将未活化的硅胶加入质量浓度为20%的盐酸溶液中，在120℃下回流并搅拌2-6h，用蒸馏水洗涤抽滤至中性，在100~150℃真空干燥箱中干燥12~24h，即得到活化硅胶。

3.根据权利要求2所述高效疏水相互作用色谱介质的应用，其特征在于：所述未活化的硅胶孔径为80~200 、粒径为5~10μm的球状硅胶。

4.根据权利要求1所述高效疏水相互作用色谱介质的应用，其特征在于：步骤（2）所述硅烷偶联剂为γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷。

5.根据权利要求1所述高效疏水相互作用色谱介质的应用，其特征在于：步骤（2）和步骤（3）中真空干燥的条件均为：在60℃下真空干燥12h。

6.根据权利要求1所述高效疏水相互作用色谱介质的应用，其特征在于：所述样品为鸡蛋清，分离制备的天然蛋白为卵清蛋白，步骤（1）将含有天然蛋白的样品进行预处理具体如下：在鸡蛋清中加入5倍体积的20.0 mmol/L、pH=6.5的KH₂PO₄缓冲溶液，搅拌均匀，在4℃、8000rpm的条件下离心处理20 min，将离心得到的上清液用0.45μm滤膜过滤后，所得滤液为预处理得到的样品，保存在4℃下，备用。

7.根据权利要求1所述高效疏水相互作用色谱介质的应用，其特征在于：所述样品为猪心，分离制备的天然蛋白为细胞色素C，步骤（1）将含有天然蛋白的样品进行预处理具体如下：将猪心清洗，去除表皮的脂肪和肌腱后，在绞肉机中绞碎至直径小于1cm的颗粒，按照1g：1mL加水稀释，调节pH为4.0，然后搅拌2 h，再调节pH为7.0，过滤，将滤液在4℃下静置12h，然后在4 ℃、8000 rpm条件下离心20 min，留取上清液，将上清液用0.45 μm的滤膜过滤得到的滤液即为预处理得到的样品，保存在4℃下，备用。