[发明专利]一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质及其制备方法与应用

说明书

本发明公开一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质，其结构式为：；本发明还公开所述高效疏水相互作用色谱介质的制备方法，包括以下步骤：（1）硅胶活化；（2）制备环氧化硅胶；（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质；同时，本发明还公开将所述高效疏水相互作用色谱介质应用于高效液相色谱中来分离制备天然蛋白卵清蛋白和细胞色素C的应用，回收简单，收回率高，制备的卵清蛋白、细胞色素C纯度高。

技术领域

本发明属于液相色谱技术领域，具体涉及一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质及其制备方法，和其用于分离天然蛋白的应用。

背景技术

天然蛋白是在自然界中存在的，不经过人工任何修饰或加工直接从天然材料中可以获得的一类蛋白。其生物安全性高，广泛地用于医药、食品等领域。例如，卵清蛋白是一种天然糖蛋白，含有386个氨基酸，相对分子质量为45KDa，其等电点为4.5。卵清蛋白无论从分子结构还是生物学功能上都与人血白蛋白非常类似，是人血白蛋白的潜在替代品。具有广泛的应用，可以经过酶水解加工成低分子活性肽具有强抗氧化活性、血管舒张活性等活性；与三价铁离子结合可作为天然载体用于开发成复合补铁剂。

此外，细胞色素C（Cyt-c）也是从天然材料中提取的一种天然蛋白，临床上用于各种组织缺氧急救的辅助治疗，如一氧化碳中毒、催眠药中毒、氰化物中毒、新生儿窒息、严重休克期缺氧、脑血管意外、脑震荡后遗症、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难和各种心脏疾患引起的心肌缺氧的治疗。与卵清白蛋白不同，分子量较小约为13 KDa，等电点10.6左右。肽链中含有19个赖氨酸残基。鸡蛋清和各类动物心脏分别富含卵清蛋白和细胞色素CC，所以其来源很方便。

目前，卵清蛋白和细胞色素C的分离主要采用多步盐析沉淀分离-离子交换色谱纯化的方法。例如，将鸡蛋清和猪心处理的样品用不同的盐（硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等）粗分离，然后再结合离子交换层析法纯化。这类方法的缺点是前者产品含盐量高，需要多次脱盐和离心等操作才能获得较高纯度的卵清白蛋白，而后者增加了纯化的步骤。有报道利用硫酸溶液提取、沸石捕集、硫酸铵分级、三氯乙酸沉淀以及离子交换色谱纯化等五大步骤提取细胞色素C，不仅整个过程繁琐，而且提取条件较剧烈，耗时长，收率也不高。

近年来，通过化学改性，使用具有两种以上的官能团的配基分子合成MMC（混合模式色谱）固定相，并将其用于蛋白质分离的研究越来越受到了关注。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱（HPHIC）介质及其制备方法，同时提供将所述介质用于天然蛋白分离的应用，分离工艺简单，分离回收率高，分离回收得到的蛋白质纯度高。

一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质，所述高效疏水相互作用色谱介质的结构式如下：

。

上述以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质的制备方法，包括以下步骤：

（1）硅胶活化；

（2）制备环氧化硅胶：按照1g：50mL将步骤（1）得到的活化硅胶加入无水甲苯中，超声处理3-5min，然后在搅拌条件下向其中缓慢加入硅烷偶联剂，所述活化硅胶和硅烷偶联剂的质量体积比为1g:1mL~1g:2 mL，升温至90-120 ℃，回流并搅拌9-12h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，真空干燥，即得到环氧硅胶；

（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质：按照体积比1:200，将苄胺加入干燥的1，4-二氧六环溶液中，超声处理3-5min，向其中加入环氧硅胶，所述环氧化硅胶和卞胺的质量比为1:2~1:4，超声处理，然后在80 ℃下回流并搅拌7h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，真空干燥，即可。