[发明专利]一种Tc1iPs细胞系及其构建方法

权利要求书

1.一种Tc1iPs细胞系，其特征在于，所述细胞系为采用Yamanaka四因子重编程方法将小鼠唐氏综合征小鼠的尾尖皮肤成纤维细胞制备成的细胞系。

2.权利要求1所述Tc1iPs细胞系的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

(1)制备Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞；

(2)制备KMSO质粒，并复苏和培养PlatE细胞；

(3)Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4病毒包装；

(4)以小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层细胞，将KMSO质粒转染入Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞中。

3.根据权利要求1所述Tc1iPs细胞系的制备方法，其特征在于，所述Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞的制备方法如下：

(1)剪取Tc1小鼠0.5-1.5cm尾尖，浸泡于2％Pen/Step的PBS中；

(2)用手术刀刮去毛发后用眼科剪将其剪成组织块，将真皮层贴于直径是3.5cm的培养皿中，并用盖玻片轻压；

(3)滴加少许15％FBS的FP培养液，过夜后加入2ml FP培养液；

(4)每2天更换新鲜FP培养液，第8-12天用0.25％的胰酶消化后按1:3进行传代培养；

(5)等细胞长至95-100％汇合度时，用成纤维细胞冻存液冻存。

4.根据权利要求1所述Tc1iPs细胞系的制备方法，其特征在于，所述小鼠胚胎成纤维细胞的制备方法如下：

(1)颈椎脱臼处死怀孕13.5天的ICR孕鼠，75％酒精消毒小鼠，剖腹取子宫置于含2％P/S的PBS中；

(2)解剖显微镜下，将小鼠胚胎一个个分离出来，去头、去四肢、去尾、去内脏；

(3)将小鼠胚胎皮肤置于1.5ml EP管中，用眼科剪将其彻底剪碎；

(4)将组织转移到50ml离心管中，加入5-10ml 0.25％胰酶，用5ml吸管反复吹吸，将组织块消化成单细胞，用10％FP培养液中止消化；

(5)1,000rpm/min离心3分钟后，用用10％FP培养液重悬细胞，按8×10⁶cells量接种于75cm²培养瓶中，第二天换液；

(6)待细胞长至100％汇合度后，消化传代，按1：3接种；

(7)细胞长至100％汇合度后，一个75cm²培养瓶细胞量冻存一管冻存细胞。

5.根据权利要求1所述Tc1iPs细胞系的制备方法，其特征在于，所述滋养层细胞的制备方法如下：

(1)小鼠胚胎成纤维细胞长至90％左右时，用浓度10ug/ml的丝裂酶素处理；

(2)丝裂酶素处理2-3小时，用无钙镁PBS洗四遍，0.25％Trypsin-EDTA消化2分钟，用2倍体积10％FP培养基终止消化；

(3)1000rpm/min离心3分钟后用10％FP培养基重悬，接种于预先用0.2％Gelatin处理过的10cm培养皿中，细胞密度控制在85％左右。

6.根据权利要求1所述Tc1iPs细胞系的制备方法，其特征在于，所述KMSO质粒转染入Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞的方法为：

(1)按相同比例混合Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4病毒上清液，加入5ul 8mg/ml的polybrene，polybrene终浓度为4ug/ml，混匀；

(2)将上述混合物加至Tc1TTF细胞培养皿中，37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养；

(3)12-16小时后，更换新鲜FP培养液；24小时后再次更换新鲜FP培养液。