[发明专利]一种检测牛诺如病毒和牛冠状病毒的引物组和双重RT-PCR方法

说明书

本发明公开了一种用于检测牛诺如病毒和牛冠状病毒的引物组，该引物组由用于检测牛诺如病毒的引物和用于检测牛冠状病毒的引物组成，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4所示。本发明还公开了一种检测牛诺如病毒和牛冠状病毒的双重RT‑PCR方法，步骤如下：（1）合成上述用于检测牛诺如病毒和牛冠状病毒的引物组；（2）提取待测样品中的RNA，以提取的RNA为模板反转录得到其cDNA；（3）以步骤（2）制得的cDNA为模板，采用步骤（1）合成的引物组进行PCR扩增反应；（4）分析PCR扩增产物。该双重RT‑PCR检测方法简便、快速、经济、高效，可以大大节约检测时间，提高检测效率。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种检测牛诺如病毒和牛冠状病毒的引物组和双重RT-PCR方法。

背景技术

犊牛感染牛诺如病毒(Bovine Norovirus,BNoV)后，临床上主要表现为腹泻、厌食、脱水等症状，而且，牛诺如病毒常与牛冠状病毒(Bovine Coronavirus，BCoV)混合感染，给养牛业带来巨大经济损失。牛诺如病毒和牛冠状病毒的感染均能引起3周龄以内的犊牛发病，且病毒引起的临床症状和剖检病变较为相似，仅靠初步的临床症状和病理剖检诊断疾病，极易造成误诊。因此，建立能够同时检测这两种病原的诊断方法尤为必要。

传统诊断牛诺如病毒与牛冠状病毒的方法有电镜检查、病毒分离、抗原抗体ELISA检测等，这些方法实验周期长，对仪器设备要求高，经济成本高，与临床上大批量样本所需的快速灵敏的检测需求不匹配。RT-PCR技术是目前诊断此两种疾病应用最广泛的方法。相较于单重RT-PCR技术，多重RT-PCR能够同时检测多种病原，非常适合于临床样品的检测，对于疾病的确诊及流行病学调查起到重要作用。

2017年我国首次检测出牛诺如病毒，牛诺如病毒在我国的流行病学调查及与其他病原共感染的情况目前国内尚无报道。因此，本实验建立的牛诺如病毒和牛冠状病毒的双重RT-PCR检测方法，能从粪便样品中成功检测出牛诺如病毒和牛冠状病毒的RNA，特异性好，可应用于牛诺如病毒和牛冠状病毒的流行病学调查，也为牛诺如病毒和牛冠状病毒的早期快速诊断奠定基础。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种检测牛诺如病毒和牛冠状病毒的引物组和双重RT-PCR方法。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明首先提供了一种用于检测牛诺如病毒和牛冠状病毒的引物组，所述引物组由用于检测牛诺如病毒的引物和用于检测牛冠状病毒的引物组成，其中，

所述用于检测牛诺如病毒的引物的核苷酸序列为：

上游引物P1：5ˊ-GGCAAACCACGCAAACAAC-3ˊ(SEQ ID NO.1)，

下游引物P2：5ˊ-CTTCCGAAAGGGCACAGA-3ˊ(SEQ ID NO.2)；

所述用于检测牛冠状病毒的引物的核苷酸序列为：

上游引物P3：5ˊ-TAGTAGTTCAGAGGTGGAT-3ˊ(SEQ ID NO.3)，

下游引物P4：5ˊ-ACAAGTCTTCAGTAGGGT-3ˊ(SEQ ID NO.4)。

上述用于检测牛诺如病毒和牛冠状病毒的引物组在制备检测牛诺如病毒和/或牛冠状病毒的试剂中的应用。

本发明还提供了一种用于检测牛诺如病毒和牛冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒的成分组成包括PCR扩增试剂；所述PCR扩增试剂包括：Premix Taq、上游引物P1、下游引物P2、上游引物P3、下游引物P4、无菌双蒸水。