[发明专利]超高效液质联用检测脑微透析液中11种神经递质的方法

说明书

本发明属于分析化学领域，具体涉及超高效液质联用检测脑微透析液中11种神经递质的方法，步骤包括：脑微透析液用乙腈‑水溶液或乙腈‑甲酸水溶液稀释配制的脑微透析样本液，用超高效液相色谱‑质谱/质谱进行定性和/或定量检测。该方法只需对脑微透析液进行简单稀释，即可通过超高效液相色谱‑质谱/质谱系统一次实现11种神经递质实时的定性和定量检测，检测结果可控、准确、稳定，方法使用性良好，且分析时间短。克服因神经递质种类多、神经递质含量低、基质效应大等导致的检测方法处理繁琐、耗时长、准确性低、数据单一等缺陷，具有可预期的临床应用前景。

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及超高效液质联用检测脑微透析液中11种神经递质的方法。

背景技术

神经递质是指由突触前神经元合成并在末梢处释放，能特异性作用于突触后神经元或效应器细胞上的受体，并能起到信息传递作用的一类化学物质。神经递质主要包括γ-氨基丁酸、谷氨酸、甘氨酸等氨基酸类，多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素等单胺类，乙酰胆碱、胆碱等胆碱类及肽类等。

大脑中枢系统内存在大量的神经递质，其含量变化对生物体的行为有着重要影响，并与多种疾病密切相关，包括抑郁症、阿尔茨海默症、癫痫、帕金森在内的多种疾病，对人的心理及生理健康造成了严重危害。有研究表明，帕金森病是由于黑质纹状体通路中多巴胺递质显著减少所致；单胺假说认为单胺类神经递质浓度水平或功能降低是抑郁症的生物学基础；脑缺血状态下的神经细胞和胶质细胞摄取EAAs功能下降或受损，使细胞外EAAs含量增高，进而导致神经元死亡，引发神经毒性。因此，对脑透析液、组织匀浆液等生物样本进行神经递质含量测定，并监测脑内神经递质含量的变化，对神经学研究及相关疾病的诊断和治疗具有重要的意义，对于揭示神经中枢中化学过程与认知、行为及情绪状态等之间的关系有着重要作用。由于大部分神经递质在生物样本中含量低、基质复杂、内源性成分干扰大，因而其含量的测定对于样本的前处理、仪器的灵敏度等均有着较高的要求。

目前，生物样本中神经递质的检测方法已经有了很多报道。单胺类神经递质较为常用的有电化学、荧光法、毛细管电泳法和液质联用法(LC-MS/MS)；氨基酸类神经递质多采用柱前衍生化后的荧光法检测；胆碱类主要采用电化学检测。不同类型神经递质的检测大都采用高效液相系统进行分离，在前处理方法和检测系统(检测器)的选择上有差异，不能实现同时检测。生物样本中神经递质的检测所面临的问题，主要包括以下几个方面：1、神经递质的含量很低，且属于内源性物质，其他物质对其干扰较大；2、单胺类成分的化学性质不稳定，在光照和碱性条件下易发生氧化分解；3、氨基酸类递质采用HPLC-荧光法需要对检测样本进行衍生化以使其产生荧光，加大了分析检测及方法学建立上的难度。

在神经递质研究的样本采集、前处理方法上，目前国内外采集的生物样本主要来源于脑组织、血液、尿液及脑脊液等。前处理方法主要有固相萃取法、有机溶剂沉淀法、固相微萃取法及微透析法。其中，微透析技术是一种能够应用于清醒或麻醉动物体内，对内源性生物分子与药物成分浓度进行同时连续监测的采样技术，具有活体、微创、实时、动态等特点。

目前用于神经递质检测的微透析技术所用探针膜长一般在3～4mm，通常用于大鼠脑内较大核团中单一种类的神经递质检测，于临床或实验监测的实时、快速、准确、数据多样化等要求仍有一定差距。因一些较小核团不适宜采用3～4mm膜长的探针进行采样，为保证脑内核团定位的准确性有必要采用膜长较小的探针进行微透析采样。而探针回收率与膜长密切相关，探针膜长越小，回收率越低，在透析液中神经递质含量较低的情况下，如何实现对多种类神经递质的同时检测仍是需要解决的问题。

电化学法和荧光法很难一次定量检测生物透析液中多种神经递质，UPLC-MS/MS结合了超高液相色谱和质谱，操作简单、灵敏度高、分析时间短、选择性高，是分析复杂生物样品中痕量成分的有力工具。UPLC-MS/MS进行神经递质定性和定量检测的生物样本均来自组织匀浆液，检出的神经递质种类和个数也有限，为了准确定量，氨基酸类和单胺类神经递质仍需衍生化，且只能进行单一种类神经递质检测。