[发明专利]一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法在审
| 申请号： | 201810987294.X | 申请日： | 2018-08-28 |
| 公开（公告）号： | CN109266774A | 公开（公告）日： | 2019-01-25 |
| 发明（设计）人： | 辛业芸;黄卫衡;吕启明;张展 | 申请（专利权）人： | 湖南杂交水稻研究中心 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 长沙市融智专利事务所 43114 | 代理人： | 袁靖 |
| 地址： | 410000*** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 水稻 表面等离子体共振 修饰 基因 单链DNA探针 分子杂交 高灵敏度 高稳定性 检测结果 快速检测 连接探针 探针分子 芯片表面 水稻DNA 垩白度 米质 探针 芯片 杂交 通用 分析 | ||
1.一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取水稻DNA作为PCR模板；
(2)设计SSR引物进行PCR扩增；
(3)设计和修饰单链DNA探针；
(4)芯片表面修饰；
(5)连接探针与芯片；
(6)PCR产物与探针分子杂交：将步骤(2)得到的PCR产物与探针进行分子杂交，反应在SPR仪上进行反应；
(7)根据检测结果，对水稻的米质垩白度进行相关性分析。
2.根据权利要求1所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤(2)SSR引物根据Chalk基因启动子区缺失的第991-979位点序列CACAAGACACTG设计。
3.根据权利要求1所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤(3)根据水稻品种9311和明恢63的Chalk5基因序列在启动子第991-979区间缺失差异，设计单链DNA探针。
4.根据权利要求3所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤(3)设计的单链DNA探针长度为20-60bp，3’端修饰生物素。
5.根据权利要求3所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤(3)设计的单链DNA探针序列如SEQ NO.1-15所示。
6.根据权利要求1所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤(4)的芯片表面修饰过程如下：
1)将羧基修饰的芯片安装到表面等离子体仪上，用缓冲液冲洗芯片表面至基线；
2)用NHS和EDC的混合水溶液流过羧基修饰的SPR芯片，进行表面活化；
3)用链霉亲和素蛋白的缓冲液流过芯片表面，将链霉亲和素蛋白固定在芯片表面；
4)用牛血清蛋白溶液流过芯片表面来封闭残存的活性位点。
7.根据权利要求1所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤(5)连接探针与芯片过程是将探针溶液流过芯片表面，使探针表面的生物素与传感芯片表面的亲和素进行反应；
步骤(6)进行之前，将步骤(2)PCR扩增产物用15×SSPE缓冲溶液和超纯水配制PCR待测产物。
8.根据权利要求7所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤(6)PCR产物与探针分子杂交的过程：取PCR待测产物，加热变性上样，反应在SPR仪上进行。
9.根据权利要求1所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤(7)以水稻品种9311与明恢63的SPR信号值为基准值，如果SPR信号值>50V，就以明恢63SPR信号值99V为基准，将其信号值减去99V；如果SPR信号值<50V，就以9311信号值50V为基准，将其信号值减去50V；SPR信号值和基准值差值的绝对值与垩白度成正相关。
10.根据权利要求1所述的一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：所述的水稻品种为籼型常规稻、籼型恢复系、籼型两系不育系或籼型三系不育系。
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