[发明专利]一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法

说明书

本发明公开了一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，包括以下步骤：(1)提取水稻DNA作为PCR模板；(2)设计SSR引物进行PCR扩增；(3)设计和修饰单链DNA探针；(4)芯片表面修饰；(5)连接探针与芯片；(6)PCR产物与探针分子杂交：将步骤(2)得到的PCR产物与探针进行分子杂交，反应在SPR仪上进行反应；(7)根据检测结果，对水稻的米质垩白度进行相关性分析。该方法具有通用、高稳定性、高灵敏度、操作简单，快速，成本低等优点；解决了水稻中垩白基因Chalk5的有效、快速检测的问题。

技术领域

本发明属于基于分子生物学和SPR光学原理的基因检测鉴定技术领域，尤其涉及一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法。

背景技术

水稻是全世界重要的粮食作物之一。我国是水稻最大的生产与消费国，随着我国经济高速发展以及人们的生活水平不断提高，人们对于水稻品质要求也在不断提升。因此，选育优良品质的水稻新品种，是水稻育种的重要目标之一。20世纪70年代开始我国大面积推广杂交水稻，并开展了一系列对于水稻米质的研究和改良，经过多年努力，我国在提高杂交水稻品质方面取得了巨大进步。但是一些米质的性质，比如垩白度，垩白粒率等优质达标率不高。垩白是衡量水稻外观品质的一个重要指标，建立快速、准确检测垩白相关基因的方法，是选择低垩白水稻品种的基础。

垩白是指稻米胚乳中组织疏松而形成的白色不透明的部分，它极大地影响了稻米可食用性产量，同时对稻米透明度等外观品质、蒸煮食味和营养品质等都有大的影响。垩白基因控制座位比较复杂，其中Chalk5是一个能显著降低稻米垩白从而提高稻米外观品质的主效基因。2014年，Chalk5已经被成功克隆。Chalk5编码一种液泡上的有无机焦磷酸水解作用和H⁺转运作用的焦磷酸转移酶。进一步的研究表明：在水稻品种中的Chalk5启动子的两个核苷酸多态性在很大程度上说明了Chalk5基因m RNA含量的不同，促进了水稻垩白的自然变异。在珍汕97和H94中，Chalk5决定了腹白、心白的形成。在另外一些品种中，垩白还受Chalk8-1、Chalk8-2、Chalk8-3和Chalk10等基因控制。另外，还有决定垩白的一些微效基因起作用。

目前认为以PCR为基础的检测方法进行Chalk5基因的检测是最好的方法。通过设计Chalk5相关引物进行普通PCR，就可以进行检测。还可以对PCR产物直接进行测序，但这种过程检测到的只是占主导地位的基因型。基因芯片也能进行Chalk5基因的检测，但成本高，常用放射性元素进行标记，对人体危害性大。随着生物传感器与基于生物传感技术的发展，表面等离子谐振技术(SPR)是近年来快速发展的一种新型生物化学检测方法。它是一种无需标记、无需分离纯化、可用于实时定量检测某些固定于传感芯片上的组分，可确定反应物种类和浓度，且可用于相对小量物质进行检测的重要手段。

SPR光学原理是基本表面等离子体谐振物理光学现象。发生谐振时的入射角依赖于金属界面的折射率，而金属界面上的生物分子的结合会改变此处的折射率，从而引起谐振角的改变，通过监测谐振角的变化，可以实现实时检测芯片表面的生物分子的结合与分离的状态。基于SPR传感器工作原理，通过生物薄膜技术，分子杂交技术等在生物表面基质层上包裹SA蛋白，SPR生物传感器对溶液中的特定的生物分子进行检测。

由于控制水稻垩白基因位点很复杂，故开发这种全新的SPR检测分析新方法很具挑战性。研发新方法的最终目的是建立一种高灵敏度、高准确性、快速检测水稻性状的检测方法，将SPR传感技术在水稻品质检测方面得到广泛应用，使选择育种更加快速有效。

发明内容

为了克服现有技术中的缺点，本发明的目的是提供一种新的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振(SPR)测定方法。该方法具有快速通用、高稳定性、高灵敏度、操作简单，成本低等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，包括以下步骤：