[发明专利]一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒及其PCR方法

说明书

本发明提供一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒及其PCR方法，其特征在于：包括用于ApoE基因分型检测的混合液和含有重组DNA的质控品，所述用于ApoE基因分型检测的混合液包括用于ApoE基因分型检测的特异性引物对、特异性探针对、Taq HS DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸混合液、反应缓冲液和反应增强剂。本发明联合采用荧光PCR‑MGB探针法和AMRS‑PCR法的基本原理，通过增加增强液，并同时优化配比，从而提高检测的灵敏度，则无需另外加入管家基因或者内参，与同类技术相比，操作更便捷，检测更迅速，准确率更高，特别适合血液基因组DNA样本的检测，适合推广应用和产业化。

技术领域

本发明涉及的试剂盒属于体外检测技术领域，是一种适合血液基因组 DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒及其PCR方法。

背景技术

ApoE是载脂蛋白E(apolipoprotein E)的缩写，ApoE主要在肝脏和脑 中产生，其主要功能是参与脂类，特别是胆固醇，在血液循环系统和中枢神 经系统的运输，并且还是低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白和乳糜微粒受体的 配体，同时参与脂和脂蛋白代谢有关酶活性的调节，ApoE的表型是由位于一 个基因上的三个等位基因所控制，即E2、E3和E4，每一个等位基因对应于 一个主要异构体产生三种纯合子(E2/E2，E3/E3，E4/E4)和三种杂合子 (E2/E3，E2/E4，E3/E4)共六种常见表型，自然人群中，E3基因频率分布 最高，在中国人群中，ApoE3/E3表型分布约占70％，ApoE基因的多态性与阿 尔海默氏症(AD)、冠心病等疾病密切相关，目前公认ApoE4基因是晚发型 AD发病的一个高风险因素，携带一个E4基因的人群(检测为E2/E4或E3/E4 分型)患AD的风险是未携带者的2-3倍,携带两个携带E4基因的人群(检 测为E4/E4分型)患AD的风险是未携带者的12-15倍。ApoE基因多态性还 与血脂异常，心脑血管疾病等有密切关系。ApoE基因分型是个体间血脂水平 差异的重要遗传因素，与血脂异常的发生密切相关。研究发现ApoE4等位基 因携带者具有较高的TC(总胆固醇)和LDL-C(低密度脂蛋白)水平，而ApoE2 等位基因携带者具有较低的TC和LDL-C水平。携带E4基因的冠心病患者心 肌梗死发生率更高，且E4等位基因与冠脉病变的严重程度具有相关性。

目前，检测ApoE基因多态性的方法有很多，包括普通的AMRS-PCR方法， 测序法，和荧光PCR法等，AMRS-PCR方法耗时较长，操作步骤繁琐，需要跑 琼脂糖电泳，涉及到环境污染的问题，而且检测的灵敏度较低。一代测序是 行业的金标准，但是由于测序需要先PCR扩增，再读取信号，不是封闭系统， 容易产生污染，荧光PCR法由于其操作步骤简便，耗时较短，准确性和灵敏 度高等优点，越来越受到广大研发人员的青睐，荧光PCR法比较常见的有HRM 法和探针法，但基于荧光PCR平台检测ApoE基因多态性的现有方法仍有一 些不足：

(1)ApoE基因涉及两个位点，多管检测操作步骤比较多且容易形成假 阳性，而单管多重PCR的检测方法，由于很多厂家的荧光PCR仪没有多个荧 光通道而检测的时候受到限制，结果分析也比较麻烦；

(2)ApoE基因的序列是典型的高GC含量的序列，用普通的荧光探针检 测灵敏度比较低，用血液基因组DNA提取试剂盒提取的DNA样本浓度大概在 10-100ng/μL左右，一些陈旧的血液提取率更低，且含有血红素等PCR抑制 剂，因此存在用了荧光PCR的方法，在特殊条件下提取的DNA的浓度过低且 含有杂质，仍然不能准确检测血液中提取的DNA样本的分型情况。

因此，研发出的一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的 试剂盒可以有效解决上述问题。

发明内容