[发明专利]体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种体外检测MUSK‑Ab和LRP4‑Ab的方法及试剂盒。该方法包括以下步骤：取293T细胞，将293T细胞转染pCMV6‑AC‑GFP‑MuSK重组质粒和/或pCMV6‑AC‑GFP‑LRP4重组质粒；向转染pCMV6‑AC‑GFP‑MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6‑AC‑GFP‑LRP4重组质粒的转染细胞添加多聚甲醛后固定15～30min；磷酸盐缓冲液洗涤之后添加牛血清白蛋白和TritonX‑100进行封闭、通透2～3h；取待测血清，添加封闭、通透后的pCMV6‑AC‑GFP‑MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6‑AC‑GFP‑LRP4重组质粒的转染细胞中，24～28℃下孵育45min～2h，磷酸盐缓冲液洗涤之后加入Alexa Fluor^TM568标记的羊抗人IgG，24～28℃下孵育45min～2h，磷酸盐缓冲液洗涤后使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发，观察并拍照记录。所使用试剂均为常规试剂，不需要依赖价格昂贵的试剂盒，检测成本较低。

技术领域

本发明属于MUSK-Ab和LRP4-Ab测定技术领域，具体涉及一种体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法及试剂盒。

背景技术

重症肌无力(Myasthenia Gravis，MG)是一种细胞依赖的、补体参与的神经肌肉接头处的自身免疫性疾病。其发病率约为1/4000-5000，所有年龄组均可受累，有两个发病高峰，女性发病高峰为20-40岁，男性发病高峰为50-70岁，临床特点包括肌肉无力和易疲劳，肌无力症状在活动后加重，休息或睡眠后缓解。早期易累及颅神经，眼外肌受累最常见，眼睑下垂和复视是常见主诉。约15％MG患者伴有胸腺瘤，70％MG患者伴有胸腺增生。MG患者血清中可以检测到多种自身抗体，约85％MG患者血清中乙酰胆碱受体抗体(AChR-Ab)阳性，称为血清反应阳性MG(SPMG)，若MG患者血清种未检测到AChR-Ab的，则称为血清反应阴性MG(SNMG)，在此类患者血清中可以通常可存在其它类型抗体如肌肉特异性酪氨酸激酶抗体(MuSK-Ab)。低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体(LRP4-Ab)是近年来发现的新的MG自身抗体，可与上述两种自身抗体同时存在，或单独致病。因此，这三种抗体联合检测将大幅提高MG诊断的灵敏度和特异性，对重症肌无力的诊断、治疗以及预后具有重要指导意义。

目前，AChR-Ab、MuSK-Ab两种MG自身抗体检测，主要采用价格昂贵的试剂，包括英国RSR公司和德国欧蒙公司的产品。采用的方法是放射性免疫技术(RIA)和/或酶联免疫方法(ELISA)。放射性免疫技术(RIA)灵敏度高，试验周期较短，但试剂的有效期短，约为1个月，不适合像中国这样一个地域辽阔国家的，而且还存在放射性污染。酶联免疫方法(ELISA)有效期长，灵敏度高和特异性强，但因为使用强酸终止液污染环境，此外酶联免疫方法因为需要依赖价格昂贵的试剂盒使得测试成本较高。

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体或抗原作为探针检查细胞内或组织内的相应抗原或抗体。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的组织或细胞，从而确定抗原或抗体的性质和定位。现有技术中没有采用细胞免疫荧光法测定MuSK-Ab的技术方案。如果要准确诊断MG，需对影响MG的多个抗体，包括LRP4-Ab和MuSK-Ab等进行联合检测。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种体外检测MUSK-Ab的方法，该方法可准确测出血清中是否存在MUSK-Ab，且检测成本较低。

本发明的第二个目的是提供一种体外检测LRP4-Ab的方法，该方法可准确、测出血清中是否存在LRP4-Ab，且检测成本较低。

本发明的第三个目的是提供一种体外检测MUSK-Ab的试剂盒。

本发明的第四个目的是提供一种体外检测LRP4-Ab的试剂盒。