[发明专利]紫斑牡丹IKU2基因制备方法

权利要求书

1.紫斑牡丹IKU2基因制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1、紫斑牡丹种子总RNA的提取；

步骤2、cDNA第一链的合成；

步骤3、紫斑牡丹IKU2基因保守区的扩增；

步骤4、PCR扩增产物的回收纯化；

步骤5、连接目的片段与克隆载体pMD 19-T；

步骤6、大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞的制备；

步骤7、连接产物的转化；

步骤8、重组质粒的提取；

步骤9、测序；将PCR检测后的质粒送往测序，对测序结果进行分析；

上述制备方法制备的紫斑牡丹IKU2基因：其具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤2中，以提取的RNA作为模板进行反转录反应，然后合成cDNA。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤3中，根据油用牡丹IKU2基因的保守区域设计特异性引物，正向引物序列FP:ATTGGTGAACCTCTCCCTTTAC反向引物序列RP:CTCTGAAGCGTCGATGTAATCA，以cDNA作为模板进行PCR扩增。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤4中，将步骤3中PCR反应产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像仪上观察，在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用干净纸巾吸尽凝胶表面液体，切除不含目的DNA部分的凝胶，减小凝胶体积，提高DNA回收率，对所切目的DNA凝胶部分进行回收纯化。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤5中，利用pMD19-T载体与目的片段连接。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤6中，步骤如下：

①大肠杆菌菌株DH5α在LB固体平板上进行划线；

②挑取生长正常的单菌落，接种于LB液体培养基中；

③取上述活化好的菌液接种至准备好的BT Media中；

④菌体用冰上预冷的BT Buffer A轻柔充分重悬菌体；

⑤菌体用冰上预冷的BT Buffer B轻柔充分重悬菌体。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤7中，具体步骤如下：

①将连接反应液加入100μL感受态细胞中，轻柔混匀后冰上静置30min；

②将离心管置于42℃水浴锅中热激90s，取出后立即在冰中放置5min；

③加入900μL预热至37℃的不含抗生素的LB液体培养基，颠倒混匀，37℃条件下180r/min振荡培养1h；

④4000rpm离心5min后弃800μL上清，将剩余菌体悬起后涂布于包含24mg/L异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG)、20mg/L 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)和50mg/L氨苄青霉素钠的LB固体培养基平板上，待菌液完全吸收后于37℃倒置培养14-16h后观察是否有菌落。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤8中，提取重组质粒，将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

9.根据权利要求1所述的紫斑牡丹IKU2基因制备方法在植物改良中的应用。