[发明专利]紫斑牡丹IKU2基因制备方法

说明书

本发明涉及紫斑牡丹IKU2基因制备方法，属于生物工程技术领域。该基因的制备方法如下：(1)紫斑牡丹种子总RNA的提取，(2)cDNA第一链的合成，(3)紫斑牡丹IKU2基因保守区的扩增，(4)PCR扩增产物的回收纯化，(5)连接目的片段与克隆载体pMD 19‑T，(6)大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞的制备，(7)连接产物的转化，(8)重组质粒的提取，(9)测序。本发明从紫斑牡丹种子不同发育时期的转录组文库中筛选得到调控种子大小的基因IKU2，为通过基因工程技术改良紫斑牡丹种子产量提供分子依据。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，本发明具体涉及紫斑牡丹IKU2基因制备方法。

背景技术

牡丹为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Oaeonia)的多年生落叶小灌木。开发利用木本油料可以有效的缓解我国食用油不足的现状，2011年3月，国家卫生部监督局根据《食品安全法》的规定及新资源食品评审专家委员会审核，公开批准牡丹籽油为新资源食品，牡丹籽油被定为新型健康木本食用油。目前中国大面积示范种植的油用牡丹品种主要有适合南方气候的凤丹(P.ostii)和适合北方气候的紫斑牡丹(P.suffruticosaAndr.var.papaveracea)。但其较小的种子(横径0.88±0.04cm、纵径1.00±0.07cm)则制约了牡丹的高效开发和利用。

紫斑牡丹具有极高的观赏价值和药用价值,它含有以高比例的不饱和脂肪酸(92％以上)和α-亚麻酸(43％以上)为特征的黑色椭圆形种子，种子油对癌症、心血管疾病、炎症和自身免疫疾病等具有明显疗效。近年来，由于牡丹籽油的价值和需求越来越大，因此解析牡丹种子大小机制和油脂合成调控机制具有重要的理论和应用价值。有文献报道，拟南芥早期胚乳和种子的大小至少受到3个基因IKU1、IKU2和MINI3调控。它们作用于同一个代谢途径，其突变体植株的胚乳数量减少且种子变小。IKU1、IKU2和MINI3突变体以隐形包子体模式在种子发育中起作用，抑制游离核时期胚乳核的增殖，导致胚乳细胞化提前发生，间接抑制胚的增殖和珠被细胞的伸长，导致种子变小^[1,2]。目前，IKU2基因的功能研究仅在拟南芥等模式植物中进行了验证，在木本油料作物，尤其是紫斑牡丹中的IKU2基因功能仍未见报道。

[1]M Luo,P Bilodeau,ES Dennis,WJ Peacock.A Chaudhury.Expression andparent-of-origin effects for FIS2,MEA,and FIE in the endosperm and embryo ofdeveloping Arabidopsis seeds.[J].Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,2000,97(19):10637.

[2]Garcia D,Saingery V,Chambrier P,et al.Arabidopsis haiku mutantsreveal new controls of seed size by endosperm.[J].Plant Physiology,2003,131(4):1661-70.

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供紫斑牡丹的IKU2基因序列，本发明的目的在于从紫斑牡丹种子不同发育时期的转录组文库中筛选得到调控种子大小的基因IKU2，提供紫斑牡丹IKU2基因的制备方法，并通过实验系统研究它的序列特征，着重解析其表达特性，为通过基因工程技术改良紫斑牡丹种子产量提供分子依据。

上述基因的制备方法具体步骤如下：

(1)紫斑牡丹种子总RNA的提取；

根据上海生工公司柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒推荐方法改进后进行油用牡丹种子总RNA的提取

(2)cDNA第一链的合成；