[发明专利]一种平板培养基酶活性测定方法

说明书

本发明涉及一种培养基中酶活性的测定方法，尤其涉及一种平板培养基酶活性测定方法，包括：①取固体培养基，加入缓冲液，粉碎；②加入琼胶酶进行处理；③取琼胶酶处理液离心上清进行酶活性测定。本发明将琼脂在较低温度粉碎结合琼胶酶作用，可以很好地提取出需要测定的酶，解决了预灌装平板培养基中酶活性测定的问题，有利于预灌装平板培养基产品的质量控制。

技术领域

本发明涉及一种培养基中酶活性的测定方法，尤其涉及一种平板培养基酶活性测定方法。

背景技术

平板培养基(culture plate)是用于获得微生物纯培养的最常用的固体培养基，它是冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中形成的培养基固体平面，也称为培养平板(plate)，也叫平面培养基、平皿培养基。平板培养基常用于微生物分离、测定菌丝生长速度、观察菌落的形态、拮抗实验、测定接种空间杂菌数。无菌培养基平皿作为一种传统微生物培养以及检测用培养基在科研和制药生产中使用十分普遍，例如微生物培养鉴定、无菌环境监测等。

微生物污染是药品质量评估的重要指标，药品生产过程中主要污染来自于微生物，根据《药品生产质量管理规范》规定，药品生产企业洁净区环境需监控浮游菌和沉降菌。结合医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法(GB/T-16294-2010)，药品生产企业必须每天高效、准确地监测药品生产环境中的微生物负荷。为避免外源性污染进人药品生产车间，2010年版GMP规定：制药企业需对洁净环境进行动态或静态监测，使用沉降菌平皿、空气浮游菌平皿和表面接触皿评估无菌生产的微生物状况。制药企业一般通过自配和购买无菌预灌装培养平皿满足其大量使用的需求。无菌预灌装培养平皿采用双层或三层抽真空包装，通过伽马射线终端灭菌，在使用时根据物料传递程序剥除外层包装，避免外源性的微生物和颗粒通过物料传递过程污染无菌生产区，因此受到无菌药品生产企业的青睐。

无菌产品在生产过程中需要进行环境监测，对于抗生物类药品生产车间环境监测所使用的培养基，沉降菌需要在环境中暴露4h，在放置过程中会有抗生素粉末落入，尤其在分装过程中粉末量大，而抗生素会抑制落入平皿中微生物的生长，需要在培养基平皿的配制过程中加入一定量的抗生素灭活酶，中和落入的抗生素粉末。使用时选取在生产过程中粉尘量大的采样点进行取样，一般为分装工序，在该位点放置无菌空皿，打开皿盖，放置4小时，然后进行培养评估环境中微生物污染情况。

含抗生素灭活酶的预罐装平皿培养基酶活性是其质量关键，抗生素灭活酶需要在45～50℃温度条件下加入溶化的琼脂培养基中，待冷却凝固后如何进行固体培养基中酶活性的分析是加酶平板培养基面临的问题。

中国发明专利CN 104263808 A公开了一种β-内酰胺酶培养基平板的活性检测方法，采用向平板中加入青霉素溶液，均匀覆盖平板，30～40℃反应后取反应液与中性羟胺溶液混合，反应一段时间后混合液加入硫酸铁胺，观察溶液颜色变化判断酶活性是否达到检测限。该方法将酶的底物抗生素加在固体培养基表面，属于液体和固体接触反应，其反应只能发生在固液界面，无法反应培养基中酶的活性。美国专利US 5,814,487公开了一种琼胶酶在核酸分离中的应用方法，在离液剂存在下琼脂加热到65～70℃液化，然后温度降到37℃，用琼胶酶作用，释放出核酸进行后续的提取。利用琼胶酶降解琼脂糖从琼脂糖凝胶中回收DNA和RNA，已经被证明是最好的方法之一。目前，已经有成熟的方法进行DNA的回收：PCR产物利用高品质低融点琼脂糖进行电泳，切下感兴趣的条带，将其放入小管里融化(温度一般在65℃～70℃)，冷却30s，加入适量琼胶酶，每100μL凝胶加入1.5μL琼胶酶(5000U/ml)，40℃左右保温直至琼脂糖完全液化，如此处理的DNA样品即可放入冰箱备用。

但含有抗生素灭活酶的琼脂培养基如果加热到65～70℃，酶活性损失很大，后续的检测就无法准确确定平皿培养基中酶的活性。离液剂KI，NaI会影响后续的酶活性分析方法。

本领域迫切需要一种能测定平皿培养基中酶活性的方法。

发明内容